共查询到10条相似文献,搜索用时 8 毫秒
1.
《天津科技大学学报》2017,(6)
目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原. 相似文献
2.
在克隆得到日本蛇根草查尔酮异构酶基因(OjCHI 702 bp)的基础上,完成OjCHI原核表达载体p ET32aCHI的构建,并对OjCHI可溶性重组蛋白的诱导表达条件进行摸索。结果显示,OjCHI可溶性重组蛋白的诱导表达条件为:IPTG浓度0.35 mmol/L,30℃下诱导10 h。按照上述条件制备并纯化获得大量符合预期大小(45.018KD)的OjCHI可溶性重组蛋白,该结果为后续研究OjCHI基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
3.
《天津科技大学学报》2016,(6)
本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)(BTG)重组基因Sprodbtg,该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、pro D-BTG基因,并将该目的基因克隆入大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体p XMJ19中构建重组质粒p XMJ19-Sprodbtg.随后,重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中进行诱导表达,并对重组菌株的诱导条件进行优化.结果表明:重组菌株C.glutamicum ATCC13032/p XMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白pro D-BTG经活化后,BTG的活力达到(41.23±2.01)U/L;在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下,BTG的活力达到最高,为(55.62±2.34)U/L,较优化前提高了约34.90%,. 相似文献
4.
5.
《科学技术与工程》2016,(23)
构建AP-57/C10orf99重组表达载体,并在BL21中进行重组蛋白的表达。经纯化获得高纯度的AP-57,从而为其功能性研究提供基础。通过合成AP-57基因序列,连接入p ET32质粒中与Trx标签和His标签融合,转化进DH5α,经筛选、鉴定为阳性克隆菌落中提取的质粒转入基因工程化BL21中进行表达。通过优化表达条件如温度、诱导时间和诱导剂(IPTG)浓度来提高重组蛋白表达量。最后,通过亲和层析浓缩获得融合蛋白,去标签和阳离子交换层析、脱盐步骤获得纯的AP-57蛋白。结果是成功构建了AP-57的诱导表达和纯化体系:当菌液OD为0.6~0.8时,用0.5 mmol/LIPTG,25℃,诱导培养6 h;通过纯化后获得的样品经质谱和SDS-PAGE鉴定为AP-57且含一个链内二硫键。实验建立了一条完整的AP-57制备工艺,为后续其功能性研究奠定了基础。 相似文献
6.
针对蛋白质核磁共振(NMR)信号复杂难以解析的问题,选用选择性标记方法可简化蛋白质NMR谱图.本实验以蛋清溶菌酶(HEL)为目标蛋白,构建了p ET-HEL蛋白表达载体,转入到大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)中,得到重组菌株.然后通过改变诱导温度、诱导浓度以及诱导时间等条件来优化HEL在大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)中的表达条件,通过SDS-PAGE电泳分析,确定了最佳表达条件:37℃、0. 4 mmol/L IPTG诱导8 h.按最佳条件于诱导前加入13C6-酪氨酸进行选择性标记,扩大表达,经过变复性处理与Ni柱纯化后,获得选择性标记的HEL.进一步制备标记蛋白核磁样品进行测定,得到简化的NMR谱.本研究为采用NMR简化分析蛋白质的结构奠定了基础. 相似文献
7.
以大肠杆菌菌株(E.coli AS 1.357)基因组为模板,PCR扩增L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因(ans B),构建p MD18-Tans B重组克隆载体和p ET-22b-ans B重组表达载体,转化大肠杆菌BL21宿主菌株,重组工程菌经IPTG诱导表达Ans B蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析纯化Ans B蛋白,利用SDS-PAGE定性分析Ans B蛋白,考马斯亮蓝法测定Ans B蛋白含量,获得纯化的质量浓度为62.7 mg/L的Ans B表达蛋白。重组L-天门冬酰胺酶的纯化收率为42.28%,酶活达137 IU/m L,较原始菌株的(6.87 IU/m L)提高近20倍,并排除大肠杆菌自身L-天门冬酰胺酶本底表达背景。 相似文献
8.
为了获得大量重组血管内皮生长因子(VEGF-A_(189))蛋白的可溶性表达,对重组VEGF-A_(189)工程菌进行发酵条件的优化并开展发酵研究.通过摇瓶培养进行可溶性发酵条件优化,在5 L发酵罐中发酵重组VEGF-A_(189)工程菌,将发酵产物经镍离子柱亲和层析纯化,并对发酵产物进行SDS-PAGE,Western Blot和ELISA等分析鉴定.结果表明,重组VEGF-A_(189)工程菌可溶性发酵条件为:37℃培养重组VEGF-A_(189)工程菌4 h,加入0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于28℃诱导表达4 h.在5 L发酵罐中按比例放大发酵,在补料发酵3.5 h后菌体密度(A_(600nm))达到8.0,调整发酵温度到28℃,IPTG诱导4 h后的菌体密度为13.72,菌体产量为40 g/L.镍离子柱亲合层析纯化后重组VEGF-A_(189)纯度达到90%以上,回收率大于80%,Western Blot、ELISA分析结果显示,重组VEGF-A_(189)蛋白和抗VEGF抗体有良好的结合活性.结果表明经过发酵条件优化后发酵可获得有免疫结合活性的可溶性重组VEGF-A_(189)蛋白. 相似文献
9.
将实验室已有的pET32a-JcHSP17.5重组载体,经测序验证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,不同温度条件下,用不同浓度异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,优化表达条件;选择镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化JcHSP-17.5蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;通过热激聚合反应来鉴定蛋白的分子伴侣活性.结果表明,17℃,200r/min,0.5mM IPTG诱导13h为JcHSP-17.5蛋白的最佳诱导表达条件,使用200mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白后,每500mL菌液可得到1.345mg的电泳纯蛋白,该蛋白在高温(45℃)条件下能够阻止苹果酸脱氢酶(MDH)发生聚合反应,表现出较强的分子伴侣活性. 相似文献
10.
抗菌肽AP-57的原核表达与纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
构建AP-57/C10orf99 重组表达载体,并在BL21中进行重组蛋白的表达,经纯化获得高纯度的AP-57,从而为其功能性研究提供基础。通过合成AP-57基因序列,连接入pET32质粒中与Trx标签和His标签融合,转化进DH5α,经筛选、鉴定为阳性克隆菌落中提取的粒转入基因工程化BL21中进行表达。通过优化表达条件如温度、诱导时间和诱导剂(IPTG)浓度来提高重组蛋白表达量;最后,通过亲和层析浓缩获得融合蛋白,去标签和阳离子交换层析、脱盐步骤获得纯的AP-57蛋白。结果是成功构建了AP-57的诱导表达和纯化体系:当菌液OD为0.6-0.8时,用0.5 mmol/LIPTG,25℃,诱导培养6 h;通过纯化后获得的样品经质谱和SDS-PAGE鉴定为AP-57且含一个链内二硫键。本实验建立了一条完整的AP-57制备工艺,为后续其功能性研究奠定了基础。 相似文献