抗癌胚抗原纳米抗体与人Fc融合蛋白在毕赤酵母和HEK293细胞中的表达、纯化和性质比较

通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究。成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力。毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统。为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考。     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与干扰素嵌合基因的构建及表达

采用重叠PCR技术，将人源性抗HBsAg单链抗体基因与干扰素γ基因用柔性肽段碱基连接成单一基因。序列测定结果表明，克隆的基因与理论上的一致，并将此基因成功构建到酵母表达载体pPICZa上，进而转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)X33中。筛选出的菌落经甲醇诱导培养，对上清液进行SDS—PAGE和WESTERN BLOT分析，在42000处可见蛋白表达带，这为进一步纯化目的蛋白和提高目的蛋白表达水平奠定了基础。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

GLP-1-Fc融合蛋白在DG44细胞中的表达及其质量分析

构建GLP-1-Fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株。收集发酵培养上清,通过离心、过滤及亲和层析等方法对目的蛋白GLP-1-Fc进行分离纯化,并利用Dot blot、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法、Edman降解等方法进行目的蛋白的质量分析,以建立GLP-1-Fc融合蛋白发酵、纯化工艺,探索该融合蛋白的质量检测方法。本实验成功构建了表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44悬浮型细胞株,通过该工艺流程,GLP-1-Fc融合蛋白表达量达到400 mg/L,纯度达95%,分子量约为3.0×10~4。该生产工艺能够获得与理论目标蛋白相一致的、且结构稳定GLP-1-Fc融合蛋白,其质量检测方法稳定可靠。     

人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达

利用人骨形成蛋白-4(hBMP4)与人骨形成蛋白-7(hBMP7)的成熟肽cDNA片段制备转基因毕赤酵母菌株,实现了hBMP4与hBMP7在巴斯德毕赤酵母细胞中的共表达.Western-blotting分析表明,表达产物含有hBMP4与hBMP7,片段大小分别为26 kD和17 kD,均为单体蛋白.     

牛肉风味强化肽（BMP）表达载体的构建

牛肉风味强化肽(Beefy Meaty Peptide,BMP)最初是从牛肉木瓜蛋白酶的水解物中分离得到的八肽,它与味精和盐具有较好的协同作用,可以呈现出牛肉风味.为了能够大量、廉价地得到这种风味小肽物质,本文根据毕赤酵母密码子偏爱性设计出4拷贝头尾相连的BMP表达基因,并将其进行体外串联,得到8拷贝、12拷贝和16拷贝的BMP表达基因,将其插入到表达载体pPIC9,从而得到4种不同的毕赤酵母的表达载体.     

大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的优化表达

尝试利用毕赤酵母的表达系统制备大黄鱼生长激素(Pseudoscraena crocea,growth hormone,pcGH).根据酵母偏好密码子设计优化的基因序列,通过化学方法合成pcGH基因,构建表达载体pPICZ A - GH,利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母X -33菌株染色体上并得以成功表达,...     

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.