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反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题,本文研究含FIXcDNA重组质粒基因治疗血友病B的可能,构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒pSCIXTN和pCIXTN,前者合SV40早期启动子和hCMV启动子共同控制的FIXcDNA,后者仅含hCMV启动于控制的FIXcDNA,它们都含有TK启动于驱动的neo基因,通过电击法将基因转移到PA317和HT1080细胞,在HT1080细胞中的FIX表达量分别为220、212ng/(106细胞·24h)通过与pCMVIX共转染靶细胞,可以增加人IX因子表达1.5~3.5倍,显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病B基因治疗中是一条潜在可行的途径.本项研究用自制的电击仪转移PA317和HT1080等细胞,最高的转移效率达10-3,并探讨了细胞种类,DNA量,DNA结构,电压,脉冲时间与转移效率及表达量的关系. 相似文献
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采用重组小鼠凝血因子Ⅸ制备单克隆抗体的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
将小鼠凝血因子Ⅸ (mFⅨ )cDNA蛋白编码区序列克隆至原核表达载体 pQE30 ,在大肠杆菌M 15中获得高效表达 (约占细菌蛋白总量的 5 1 2 % ) ,并经过SDS PAGE纯化获得均一的重组mFⅨ蛋白 .以此蛋白为抗原 ,免疫Lou/MN系大鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (Sp 2 / 0 )融合后 ,经 3次克隆化选择获 2株杂交瘤细胞(H4B5和C2B10 ) .以 1× 10 6杂交瘤细胞注射免疫缺陷型裸鼠 ,10d后获得腹水 .对此单抗的功能和特异性初步研究表明 ,所制备的抗小鼠FⅨ单抗可用于Western免疫印迹等研究 . 相似文献
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构建了带有人hFⅨ cDNA及不同调控顺序的重组质粒和反转录病毒载体,系统比较了不同启动子,增强子在不同靶细胞中对hFⅨ cDNA表达的作用,MoMLV病毒的LTR启动子在小鼠成纤维细胞中控制转录能力较强,还研究了hFⅨ基因自身内含子Ⅰ及IL-2基因内含子对hFⅨ cDNA的表达增强艇,并就双启子和选择基因对hFⅨ cDNA表达的影响进行了实验探讨。 相似文献
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凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠遗传稳定性及其临床表型研究 总被引:7,自引:0,他引:7
通过对凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠遗传稳定性及其相应临床表型的研究,为以该动物模型为研究对象的血友病B基因治疗提供相应背景资料,遗传分析表明,该小鼠繁殖过程中无回复突变出现,亦未发现Ⅸ因子基因未敲除部分被转录的证据;血浆PT,KPTT和Ⅸ因子活性检定结果提示该小鼠符合人血友病B相应临床表征。 相似文献
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小鼠凝血因子Ⅸ基因组DNA的结构分析和ES细胞基因打靶研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了利用ES细胞基因打靶技术建立人血友病B的转基因小鼠模型,用小鼠FIX基因cDNA为探针,筛选129Sv小鼠的基因组DNA噬菌体文库,从2*10^5个噬斑中得到5个独立的阳性噬菌体克隆。 相似文献
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ZHUHuanzhang CHENXiaoguang LIFeng GONGJuli XUEJinglun 《科学通报(英文版)》2003,48(20):2196-2200
To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B. 相似文献
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近年来,随着生物工程技术的发展,人们已成功地将两种不同目的蛋白的基因构建于同一表达载体。这种双基因载体的构建克服了单一目的基因表达载体的不足.已在农业、医药和生物工程基础理论研究中得到广泛应用。 相似文献
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基因重组质粒稳定性与苯丙氨酸发酵的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究应用具有苯丙氨酸生产基因 pheA~(FR)、aroF~(FR)、CI_(857) 的质粒 pSY130~14和质粒 pS Y16,重组构建了具有苯丙氨酸生产基因系统的新质粒 pSY200-14。然后,使其转化到大肠菌 AT2471中,育成了基因重组菌株 AT2471/pSY200-14。试验表明,新菌株质粒稳定性比原菌株有较大的提高。在2. 5升通气搅拌罐进行苯丙氨酸发酵试验,在搅拌转速850rpm、通气速率1. 0VVM,38. 5℃和 pH7. 0的条件下,发酵48小时苯丙氨酸生成量达14. 2g/L,比原菌株 AT2471/pSY130-14增产11. 8%。 相似文献
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血友病B是凝血因子Ⅸ(hFⅨ)缺乏所导致的严重凝血功能障碍、X-连锁隐性遗传性疾病,在男性中的发病率为三万分之一.目前没有理想的治疗措施,而基因治疗可能是根治该病的安全、有效方法.该实验构建了ubiquitin—c和ABP(肝特异性)启动子指导hFⅨ表达的载体FUXW、FAXW,利用磷酸钙法共转染三质粒制备高滴度的重组慢病毒.将不同剂量的重组FUXW、FAXW病毒,分别用尾静脉液压法和静脉缓注法注射入血友病B小鼠体内,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为45ng/mL,表达持续超过60d.结果表明:hFⅨ蛋白的表达与病毒的剂量成正相关,重组FAXW病毒的hFⅨ表达量高于重组FUXW病毒,而尾静脉液压组和静脉缓注组在表达量、表达时间上没有显著差异. 相似文献
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人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器的研制 总被引:5,自引:0,他引:5
邱信芳 《复旦学报(自然科学版)》1998,37(4):365-371
为了建立人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器,以MCK增强子,β-actin启动子控制hFIX小基因表达顺序,反向插入G1Na框架,构建复制缺陷反转录病毒载本,并制备重组反围录病毒颗粒; 相似文献
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小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达 总被引:2,自引:0,他引:2
造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量. 相似文献
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氧化硫硫杆菌重组质粒pSDT125的构建及其在大肠杆菌之间的转移 总被引:3,自引:0,他引:3
对氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)隐蔽性质粒pTt12进行了限制性酶切分析,并绘出了限制性酶切图谱,其大小为13.7Kb.将pTt12质粒与pBR325质粒重组,得到了重组质粒pSDT125(Cm',Ap',Tc~s).氧化硫硫杆菌重组质粒pSDT125本身不具有接合转移能力,但它在广泛寄主范围的转移性质粒RP4的带动下以较高的频率在大肠杆菌(Escherichia coli)之间转移,表明在氧化硫硫杆菌质粒pTt12上存在着与接合转移有关的DNA序列. 相似文献
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植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。 相似文献
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利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。 相似文献
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目的:通过构建人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体,为深入研究淋巴细胞的生物学功能奠定实验基础。方法:采用DNA重组技术,以人新鲜扁桃体淋巴细胞为实验材料从中提取mRNA,以mRNA为模板合成cDNA,然后与质粒pSPORTI进行定向连接并转入到E.coliJM109中进行分子克隆。结果:阳性克隆占90%,阴性克隆占10%;转化率为1.35×104克隆/微开连接体系;插入片段长度为0.5~2.3Kb,平均1.3Kb。结论:人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体构建成功。 相似文献
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