α－球蛋白基因缺失的DNA扩增指纹图谱法分析

应用计算机辅助设计，选择α－珠蛋白基因簇中断裂好发部位或其外侧一致ＤＮＡ序列设计引物，在包含低温退火的条件下，扩增并分析α－珠蛋白基因缺失的ＤＮＡ指纹图谱，并据此对６１例α－地中海贫血病人进行了基因分型诊断．该方法稳定、可靠，可望用于临床诊断．     

α—珠蛋白基因的PCR检测

用多对引物的复合ＰＣＲ技术，分别扩增α－珠蛋白基因族中α１和α２基因片段；参照β－珠蛋白基因ＰＣＲ扩增产物量，判断α１和α２基因是否正常，是否为缺失的纯合子或杂合子，对α－地中海贫血症先征者家系基因型进行ＰＣＲ分型诊断。     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

TNF－α诱导的蛋白质因子与淋巴毒素基因5’端上游区特异性结合的研究

淋巴毒素（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，凝胶迟滞电泳分析发现，ＴＮＦ－α诱导３０ｍｉｎ的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物与ＬＴ基因５＇上游片段可形成多种ＤＮＡ－蛋白质复合物．ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验发现，ＬＴ基因５＇端上游－１０６～－８３ｂＰ（共２４ｂＰ）序列具有蛋口保护足迹：此２４ｂｐ的序列中存在一个ｋＢ样结合位点：－１００～－９０ｂＰ（５＇－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３＇）．以此蛋白保护足迹区序列而设计合成的寡核苷酸探针进行的凝胶迟滞电泳分析及竞争反应表明，ＮＦ－ｋＢ类蛋白因子参与了此序列的ＤＮＡ－蛋白质的特异性结合，提示ＴＮＦ－α可能通过激活ＮＦ－ｋＢ类蛋白质因子参与ＬＴ基因的表达调控．     

RT—PCR法检测SMMC—7721人肝癌细胞α5β1整合蛋白 …

整合蛋白α５β１是一类存在于细胞表面的细胞粘附分子，在肝癌的发生发展和演进中起着重要的作用。研究了快速定量检测整合蛋白α５β１ ｍＲＮＡ表达的ＲＴ－ＰＣＲ方法，结果表明：在ＰＣＲ反应体系中加入２５ｎｇ到２００ｎｇ ｍＲＮＡ的逆转录产物呈较好的线性关系，并以此为反应条件测定ｐｃＤＮＡ３－α５，ｐｃＤＮＡ３－β１质粒共转染或单转染的α５β１．６－７７２１，α５．３－７７２１，β１．６－７７２１细胞株ｍ     

肠炎沙门氏菌2种rDNA 16s—23s基因间隔区序列分析

采用凝胶分离ＰＣＲ产物的方法，对肠炎沙门氏菌中种ｒＤＮＡ１６ｓ－２３ｓ基因间隔区进行克隆和序列分析。肠为沙门氏菌小ｒＤＮＡ１６ｓ－２３ｓ基因间隔区，全长３５４个碱基对，包含１个谷氨酸ｔＲＮＡ基因。大ｒＤＮＡ１６ｓ－２３ｓ基因间隔区，全长５１８个碱基对，其中包含异亮氨酸和丙氨酸２个ｔＲＮＡ基因。它们分别与大肠杆菌的２个ｒＲＮＡ操纵子ｒｒｎＥ和ｒｒｎＨ有较高的序列相似性。肠炎沙门氏菌大ｒＤＮＡ１６ｓ－     

血管内皮细胞中表达的TNFα诱导基因的分离

使用一种快速而高效的分离差别表达基因的新方法－抑制消减杂交法，分离了在ＴＮＦα作用后血管内皮细胞中差异宾ｃＤＮＡ，并经反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交试验证实。初步确认ＴＮＦα作用后诱导血管内皮细胞内一些分子的表达，为进一步研究了ＴＮＦα对血管内皮细胞的作用机制打下了基础。     

用α—珠蛋白基因探针对两例Hb—Bart''''s胎儿双亲的α—基因的探测

采用限制性内切酶印迹杂交放射性自显影技术和α—珠蛋白基因探针分析了二例Hb—Bart's胎儿水肿综合征及其双亲的α—珠蛋白基因,其分析结果表明:Hb—Bart's胎儿水肿综合征没有α—基因;其双亲则以内切酶HindⅢ消化其DNA得到17、4.5、3.8kb α—基因特异片段,用内切酶Bgl Ⅱ消化则得12.3、7.2kb二个α—基因特异片段。其基因图谱与正常人相似,为正常人的一半。     

苏云金芽孢杆菌新分离株S11—11δ—内毒素基因在Btk.BE …

用对鳞翅目夜蛾科幼虫有很强毒杀作用的土壤新分离株Ｓ１１－１１为δ－内毒素基因的供体菌，以穿梭质粒ＰＨＴ３１０１为载体，用Ｐｓｔ Ｉ和ＥｏｏｒＩ分别对供体和载体ＤＮＡ作双酶切，并将酶切片段用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，用电激法将重组ＤＮＡ转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ．ＢＥ２０中，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察证明，δ－内毒素基因在Ｂｔｋ．ＢＥ２０中得到表达，并具有较高的表达量。生物测定     

非胰岛素依赖型糖尿病与胰岛素基因发迹的实验研究

用分子生物学的实验方法对非胰岛依赖型糖尿病进行胰岛基因检测。从ＮＩＤＤＭ患者外周血的白细胞中提取ＤＮＡ，以胰岛素基因５’－末端上游的某一ＤＮＡ序列为引物，对特定的靶序列进行体外扩增，即ＴａｑＤＮＡ聚边式反应，将其扩增产物进行电泳分离，在紫外分析仪下观察结果并与正常人对照，发现１６例ＮＩＤＤＭ患者胰岛素基因有所改变。     

腺相关病毒介导带基因座控制区核心序列的β—珠蛋白基因在红？…

为提高人β－珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平，构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β－珠蛋白基因相关病毒（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）载体ＡＶ５３ＨＳ２△β２Ｎｅｏ和ＡＶ５３ＨＳ４３２△β２Ｎｅｏ。利用ＡＡＶ载体介导的基因转移将两种重组体导入红系细胞（ＭＥＬ），分析了它们在ＭＥＬ细胞中的整合与表达。结果表明，ＡＡＶ载体介导带多个基因座控制区核心序     

人凝血因子ⅨcDNA离体表达调控的研究

构建了带有人ｈＦⅨ ｃＤＮＡ及不同调控顺序的重组质粒和反转录病毒载体，系统比较了不同启动子，增强子在不同靶细胞中对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ表达的作用，ＭｏＭＬＶ病毒的ＬＴＲ启动子在小鼠成纤维细胞中控制转录能力较强，还研究了ｈＦⅨ基因自身内含子Ⅰ及ＩＬ－２基因内含子对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ的表达增强艇，并就双启子和选择基因对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ表达的影响进行了实验探讨。     

α—地中海贫血患者的α—珠蛋白基因组织的分析

α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因全部和部分缺失所致的一种遗传性溶血性贫血综合征。本文从重组质粒pHα_2中提取和纯化α_2片段(1.6kb),以α-~(32)p-dCTP标记做珠蛋白基因探针对Hb-H病人和Hb-Bart水肿综合征的血细胞DNA进行限制性内切酶谱分析。用HindⅢ和BglⅡ酶解Hb-H病人的非缺失型分别得16.4、4.5和3.8Kb三个特异片段和12.5、7.5二个片段。而Hb-H缺失型病人分别得到16.4、4.5和7.5或16Kb特异的α-基因片段。酶解Hb-Bart胎儿血DNA则没有α-基因特异片段。     

TNF—α诱导的蛋白质因子与淋巴毒素基因5‘端上游区特异性…

淋巴毒素（ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，凝胶迟滞电泳分析发现，ＴＮＦ－α诱导３０ｍｉｎ的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物下ＬＴ基因５＇上游片段可形成多种ＤＮＡ－蛋白质复合物。ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验发现，ＬＴ基因５＇端上游－１０６￣－８３ｂｐ（共２４ｂｐ）序列具有蛋白保护足迹；此２４ｂｐ的序列中存在一个ｋＢ样结合位点：－１００￣－９０ｂｐ（５＇－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３＇）。以此蛋白保护足迹     

质粒PBR322—脂质体的制备及其内含DNA的转移

采用改进的逆相蒸发法（ＲＥＶ）制备卵磷脂／胆固醇（７：３，ｍｏｌ／ｍｏｌ）脂质体，并用于包裹荧光特异标记的质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ，构建了基因转移载体。然后将纯化的质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ－脂质体与悬浮的白菜原生质体一起温育。经过ＤＮＡ－ＤＡＰＩ荧光复合物的镜检，证明ＤＮＡ被包裹到卵磷脂／胆固醇脂质体内。被包装的ＤＮＡ能有效地避免外源ＤＮＡａｓｃ的降解作用。且质粒ＤＮＡ通过脂质体与原生质体膜的融合可随     

克隆含有MT—I和MT—Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ作为探针，从１２９小鼠的基因组库中获得含ＭＴ－Ⅰ基因的ＤＮＡ片段。从６．８＊１０＾５的噬菌斑中挑出４个阳性噬菌体克隆，分别命名为１－１，２－２，１－６和４－３。     

Quox—1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的Ｑｕｏｘ－１基因ｃＤＮＡ的ｃ３片段为探针，与豚鼠基因组ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果表明，在豚鼠基因组中存在Ｑｕｏｘ－１基因同源序列，以抗ＱＵＯＸ－１蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸，附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析，发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类ＱＵＯＸ－１蛋白提示Ｑｕｏｘ－１基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

腺相关病毒介导带基因座控制区核心序列的β-珠蛋白基因在红系细胞中整合与表达

为提高人β-珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平,构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β-珠蛋白基因腺相关病毒ade-no-associatde vits,AAV)载体AV531E2Δβ2Neo和AV53HS432Δβ2pNeo．利用AAV载体介导的基因转移将两种重组体导入红系细胞(MEL),分析了它们在MEL细胞中的整合与表达．结果表明,AAV载体介导带多个基因座控制区核心序列的人β-口珠蛋白基因在MEL细胞中较稳定整合,呈现与内源α-珠蛋白基因可比的表达水平．