黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在酿酒酵母中的表达

从黑曲霉(Aspergillus niger)克隆木聚糖酶基因xynB,利用重叠延伸PCR法去除其中的内含子.将该基因与质粒pYES2连接,构建真核表达载体,用醋酸锂化转法导人酿酒酵母(Sacharom yces cerevisiae)INVSC1菌株表达.利用α信号肽替换基因原信号肽,以考察信号肽对表达蛋白分泌的影响.结果获得2株重组菌株,分别为xynB连接原信号肽的pYES2-xynB菌株和xynB连接α信号肽的pYES2-xynB-α菌株.木聚糖酶B成功表达,SDS-PAGE检测到约24kDa目的蛋白质条带.木聚糖酶B最适催化温度为50℃,最适催化pH值为5.0,Mn2+对酶活具有强烈的抑制作用.将α信号肽取代原信号肽使酶活达到最高的诱导时间由72h缩短为48h,但是置换信号肽使最高酶活由7.59U降低为3.97U.     

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.     

阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达

研究阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及重组阿魏酸酯酶的酶学特性.化学合成fae基因序列,构建分泌型重组质粒pPIC9K-fae,经线性化后电转化至毕赤酵母GS115,对筛选出的高活性转化子进行诱导表达.SDS-PAGE分析显示:发酵上清液为单一条带,表观相对分子质量为42 ku,酶活为78.49 nkat·mL^-1,比活力为524.38 nkat·mg^-1,最适反应温度为50 ℃,在40~45 ℃温度范围内较稳定,最适反应p     

大米草半纤维素选择性酶解研究

采用由东方肉座菌EU7-22表达的重组木聚糖酶HoXyn11A、黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖酶AnXyn10C和商品木聚糖酶分别降解大米草半纤维素,探索其降解的最佳工艺条件,结果发现该3种木聚糖酶最适pH值为4.5～5.5,最佳反应温度为45～55 ℃,酶用量为200～300 IU·g^-1底物,反应时间为12～24 h.对比结果表明:通过黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖AnXyn10C能够在24 h内基本将大米草半纤维素降解为低聚木糖,效率远高于商品酶和东方肉座菌EU7-22表达的重组木聚糖酶HoXyn11A.黑曲霉BE-2表达的重组木聚糖AnXyn10C是大米草半纤维素降解酶的良好来源.     

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

pVT102U/α-bgln重组真核表达质粒的构建和鉴定

构建重组真核表达质粒pVT102U/α-bgln使之可以在酿酒酵母中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以含有从黑曲霉中获得的编码β-葡萄糖苷酶(bgln)成熟肽的cDNA的克隆质粒pMD19T-bgln为模板,用PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln),利用真核表达载体pVT102U/α构建pVT102U/α-bgln重组质粒,PCR结果显示扩增片段约2.6 kb,与预期相同.用酶切电泳验证重组结果的正确性,重组质粒酶切后显示其大小约10 kb,大小及酶切图谱与预期相同.测序检测质粒重组后序列情况,经测序发现插入片段两端序列无改变,且读码框正确.pVT102U/α-bgln质粒构建成功.     

豆豉中β-甘露聚糖酶高产菌的分离、鉴定及其酶学性质

通过对传统曲霉型豆豉菌群分离纯化,结合刚果红显色及DNS筛选法,共得到高产β-甘露聚糖酶且形态学差异较大的细菌4株、真菌1株,其中真菌的酶活力为2 016 U?mL^-1.经过序列鉴定与比对,细菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)不同种,真菌为黑曲霉(Aspergillus niger).酶学性质研究表明:黑曲霉的最适温度和pH值分别为60 ℃和5.0; 4株芽孢杆菌最适作用温度和pH值范围为40～55 ℃和6.0～7.0,其中1株芽孢杆菌在65 ℃时保温240 min或在pH值为9.0时保留30 min,残留相对酶活仍可达61.4%或84.3%.     

重组腺相关病毒基因药物三种滴度的比较与分析

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)和转导方法对重组腺相关病毒(rAAV)的衣壳滴度、基因组滴度、转导滴度进行定量,并比较衣壳滴度/基因组滴度(P/GC)和基因组滴度/转导滴度(GC/TU).实验结果表明:3批rAAV的平均衣壳滴度为3.65×10¹³ P·mL^-1,平均基因组滴度为8.67×10¹¹ GC·mL^-1,平均转导滴度为9.85×10⁹ TU·mL^-1,P/GC平均值为41.70,GC/TU平均值为88.20,P/GC和GC/TU平均值接近于AAV2标准品,说明文中方法的制备工艺成熟、稳定,制备的rAAV感染活性较高.     

绿色木霉BGL Ⅰ基因在酿酒酵母中的克隆表达及其纤维素乙醇发酵

采用反转录PCR方法从绿色木霉AS3.3711的总mRNA中获得了编码β-葡萄糖苷酶Ⅰ(BGL Ⅰ)的基因bgl1.序列测定表明该基因片段长2235 bp,编码744个氨基酸残基,与里氏木霉的bgl1序列完全相同.将其插入高拷贝数整合型表达载体PScIKP,构建了重组质粒PScIKP-bgl1.线性化后转化工业酿酒酵母AS2.489菌株,利用高浓度G418筛选高抗转化子,经SDS-PAGE蛋白电泳证明获得了能高效稳定分泌表达重组BGL Ⅰ的转化子.重组BGL Ⅰ酶能直接水解培养液中的纤维二糖,在84 h测得酶活最大值为0.978 u/mL.重组BGL Ⅰ酶最佳反应温度为60℃,最适反应pH为4.0～5.0,并且能以纤维二糖为惟一碳源发酵乙醇,发酵90h能够用重铬酸钾氧化比色法检测到乙醇的体积分数为0.51%.结果表明:成功克隆并在酿酒酵母中表达了一种高活性的β-葡萄糖苷酶,对于工业上直接利用纤维素为惟一碳源发酵生产乙醇的研究有重要意义.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

酶解章鱼下脚料的产物分析

为了提高下脚料的综合利用率,用4种商业蛋白酶对章鱼下脚料进行水解,并初步分析检测产物中的氨基酸和抗氧化多肽.实验结果表明:动物蛋白酶水解液中的复合氨基酸获取率占总氨基酸的57.12%,达到57.12%;而4种蛋白酶水解产物中肽类物质的·OH清除力IC50均小于1.28 mg·mL^-1,Fe²⁺螯合力IC50均小于2.82 mg·mL^-1,还原力随多肽质量浓度增加而提升;这种工艺条件和方法可以同时获取两类活性物质(复合氨基酸、抗氧化性多肽),     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选

采用牛津杯平板透明圈法对研究室保藏的17株黑曲霉菌株进行了β-葡萄糖苷酶产生菌初筛,得到5株透明圈相对明显的菌株,经固态发酵产酶复筛及相关纤维素酶活力的检测,选出一株β-葡萄糖苷酶酶活力高、且纤维素酶活力也较高的菌株niger-2,其β-葡萄糖苷酶酶活力为78.75 U/g、纤维素酶(CMC)活力为312.15 U/g...     

响应面法优化黑曲霉产β-葡萄糖苷酶培养基的研究

为获得黑曲霉Aspergillus niger M85菌株较高的β-葡萄糖苷酶酶活,本文采用响应面法对该菌株产β-葡萄糖苷酶关键发酵过程参数进行优化。Plackett - Burman试验结果表明,麸皮和MgSO4?7H2O的浓度对产酶结果影响显著。采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,得到麸皮浓度为17 g/L,MgSO4?7H2O浓度为8 g/L,结合中心组合实验及响应面法分析建立了以β-葡萄糖苷酶酶活力为响应值的二次回归方程模型：Y=-19.1057+0.4526X2+ 3.8260X5-0.02775X2X5- 6.3569×10-3X22-0.2085X52 。对方程求极值点得到优化的发酵过程参数：麸皮浓度为18.345 g/L,MgSO4?7H2O浓度为7.963 g/L。在优化后的发酵条件下培养4天,菌株产β-葡萄糖苷酶活力可达0.2640 U/mL,比优化前提高了61.97%。预测模型可靠性高,可应用于β-葡萄糖苷酶发酵条件的优化。产酶进程结果表明：发酵5天后β-葡萄糖苷酶活力可达到最高值0.3334 U/mL,还原糖浓度仅为0.49g/L。     

液态混合菌发酵优化纤维素酶组分

在里氏木霉和黑曲霉液态混合条件下培养纤维素酶,分析两个菌种的接种比和延迟黑曲霉的接种时间对产酶的影响,探讨两个菌种发挥协同作用的最佳条件。结果表明:黑曲霉延迟接种48 h及里氏木霉与黑曲霉接种质量比1∶1时,所产纤维素酶的滤纸酶活为1.163μmol/(min.mL);β-葡萄糖苷酶活为0.606μmol/(min.mL),β-葡萄糖苷酶活与滤纸酶活比值为0.521,比单一里氏木霉产纤维素酶的酶活高,并在后续的酶解效果对比中表现最佳。48 h时的酶解得率为65.61%,高于里氏木霉单一培养时所产纤维素酶的得率53.91%和商品纤维素酶的得率49.64%。说明通过混合发酵,纤维素酶的组分得到了优化。     

pDNA-巯基壳聚糖纳米粒的制备及Box-Behnken效应面法工艺优化

以巯基壳聚糖(TCS)为基因载体,采用离子交联法制备能用于基因口服研究的质粒DNA-巯基壳聚糖纳米粒(pDNA-TCS-NPs).分别以TCS质量浓度、三聚磷酸钠(TPP)质量浓度、pH值和转速为考察对象,以pDNA-TCS-NPs粒径和Zeta电位为评价指标,采用4因素3水平Box-Behnken 效应面法筛选最佳制备工艺,并对其外观形态,包封率等体外性质进行考察.结果表明:TCS质量浓度为0.80 mg·mL^-1,TPP质量浓度为0.65 mg·mL^-1,pH=5.3,转速为2 000 r·min^-1是最优制备工艺,可制得粒径为(134.21±1.34)nm,Zeta电位为(24.36±0.29)mV,包封率在(80.26±0.56)%,形状规则且分散良好的pDNA-巯基壳聚糖纳米粒;Box-Behnken 实验设计可用于预测和优化pDNA-TCS-NP制备工艺优化筛选.     

产蛋白酶和淀粉酶菌株的筛选及其发酵产酶特性研究

利用酪蛋白固体平板分离培养基、淀粉平板分离固体培养基初筛,液体发酵产酶培养基摇瓶复筛相结合,从实验室保藏的真菌茵株中筛选出一株产蛋白酶的真茵菌株和一株产淀粉酶的真茵茵株,对其固态发酵特性进行了研究．结果表明：蛋白酶产酶高峰为24h,酶活力达到3760tJ／g;淀粉酶产酶高峰为32h,酶活力达到0．405u／g．