转OsNHX1基因耐盐84K杨的培育

采用农杆菌介导的方法将水稻Na+/H+反向转运器基因OsNHX1导入84K杨, 获得3株抗性转化植株, PCR, Southern 和Northern检测结果表明, OsNHX1基因已经整合到84K杨基因组中, 并可以稳定表达. 耐盐实验表明, 3个株系的转基因植株能在200 mmol/L NaCl条件下正常生长. 对盐胁迫处理的转基因植株进行Na+含量和渗透势测定, 发现转基因植株叶片中的Na+明显高于对照植株, 其渗透势明显低于对照植株. 分子检测和耐盐性实验表明OsNHX1基因的转化获得成功, 并获得84K杨耐盐转基因 植株.     

大豆GmNHX1在百脉根中的过表达研究: 体内Na+含量的降低是耐盐性提高的基础

从大豆中克隆到了液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白编码基因(GmNHX1)的全长cDNA, 包括5′端非翻译区464 bp, 编码区1641 bp, 3′端非翻译区486 bp, 共2591 bp. 该cDNA编码的GmNHX1蛋白共546个氨基酸, 具有典型的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白特征, 与已知功能的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白AtNHX1, OsNHX1及AgNHX1具有较高的同源性. GmNHX1在大豆基因组中为单拷贝基因, 其表达具有组织特异性, 并能受到NaCl, KCl, LiCl, ABA以及脱水等胁迫上调; 耐盐品种GmNHX1的转录水平在叶片中低于而在根系和下胚轴中均高于敏盐品种. 将GmNHX1 cDNA置于两个串联的CaMV35S启动子控制下在豆科模式植物百脉根中过表达, 提高了转基因百脉根的耐盐性. Na⁺及K⁺含量测定表明, 与对照相比, 过表达GmNHX1的百脉根小苗中Na⁺, K⁺含量显著降低, K⁺/Na⁺比率显著增加, 显示了百脉根中过表达GmNHX1所导致的耐盐性与减少转基因植物中Na⁺的积累有密切关系.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶. 采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321, 通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达. 抗盐抗旱检测结果表明, 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸, 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5~15倍; 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快, 苗与根的生物学产量都要高于对照, 最后种子产量也显著高于对照, 如在0.1 mol/L NaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%~41%, 说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用, 通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达, 有效提高植物的抗逆性. 利用酵母单杂交技术从大豆(Glycine max)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因. 该基因编码174个氨基酸, 具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域, 其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E), 在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区. 利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体, 通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号, 获得103株T₀代再生植株, 通过PCR检测, 分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株. T₁代经过PCR, Southern blot, RT-PCR检测, 证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中, 并在转录水平上表达. 携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T₁代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明, 转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高, 说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

耐辐射球菌抗氧化系统中的一个新成员dr1127

构建了一个耐辐射球菌(Deinococcus radioduran)未知基因dr1127的功能缺陷株MT1127. γ射线和H₂O₂处理R1和 MT1127的结果表明, dr1127基因的缺失影响了耐辐射球菌的辐射抗性和氧化抗性. 测试了指数生长期和稳定期的R1株和 MT1127株的细胞提取物活性氧自由基清除能力, 结果发现, 无论是超氧阴离子、H2O2还是羟自由基, MT1127株均表现为更弱的自由基清除能力, 这些结果与前面的生存率实验结果相吻合, 也在一定程度上帮助我们理解dr1127基因的功能. 同时, 在大肠杆菌BL21 (DE3)系统中成功表达了dr1127基因产物, 纯化得到46 kD的蛋白产物, 利用Fe²⁺-H₂O₂氧化损伤系统, 检测到DR1127蛋白在体外保护DNA免受氧化损伤的功能, 并测到该蛋白能通过结合双链DNA的方式来实现保护DNA的功能. 本研究揭示了dr1127基因在氧化损伤胁迫中的功能, 为耐辐射球菌庞大而又复杂的抗氧化系统增添了新的成员, 也为深入研究耐辐射球菌的超强辐射抗性开辟了一个新的研究思路.     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

拟南芥中AtMEK5激活导致不依赖于水杨酸信号途径的细胞死亡

用MBP作为磷酸化底物的凝胶内激酶活性分析结果显示，在转基因拟南芥植株中诱导表达组成型激活的AtMEK₅蛋白（AtMEK₅^DD）引起的细胞死亡和用带有avr Rpt2基因的病原菌P. Syringe处理转基因植株导致的超敏性细胞死亡过程中，44kDa和48kDa的两个MAPK均被激活；AtMEK₅^DD在NahG转基因烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥杂交植株AtMEK₅^DD x NahG中诱导表达依然引起细胞死亡，且杂交植株中AtMEK₅^DD表达并未引起水杨酸含量的显著变化； Northern检测结果显示，病原菌处理可显著诱导AtMEK₅^DD转基因植株中PAL、PR1和PR5 基因的大量转录，而AtMEK₅^DD的表达仅导致PR5 基因的大量转录；表明有别于超敏性细胞死亡的水杨酸依赖特性，AtMEK₅激活引起的细胞死亡不依赖于水杨酸信号途径。     

抑制4CL基因表达获得低木质素含量的转基因毛白杨

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将反义4CL(4-coumarate:CoA ligase, 4-香豆酸辅酶A连接酶)基因转入三倍体毛白杨(Populus tomentosa). PCR及Southern检测证实外源基因已整合到转基因植株总基因组中. RT-PCR和Western检测表明反义4CL基因在转基因植物体内已表达. Klason木质素含量测定结果显示, 抑制内源4CL基因的表达可显著降低转基因株系的木质素含量, 比非转基因对照下降最高达41.73%. 但综纤维素含量测定结果表明, 转基因植株与对照没有明显区别, 推测4CL可能并非木质素与碳水化合物的代谢调节点. 转基因植株茎杆剥皮后呈现程度不等的红褐色, 而对照为白色, 其他生长发育特征与对照无明显差异. Wiesner反应结果表明, 木质素含量下降的株系呈红色, 而对照呈典型紫红色.     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶AtPLC6基因的克隆与表达

利用文库筛选和RT-PCR方法, 从拟南芥中克隆到长度为1954 bp, 包括全长1734 bp编码区的AtPLC6 cDNA, 推测其编码一含有578个氨基酸的多肽, 其等电点为7.24, 分子量为66251.84 Da. 在GenBank中进行序列比对发现, AtPLC6为一新发现的拟南芥PI-PLC基因. 对推测的氨基酸序列结构的分析表明, AtPLC6具有EF手性结构、X结构域、Y结构域和C2结构域, 与植物中已知的其他磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)在结构上相似, 类似于动物中典型的δ-型磷酸肌醇特异性磷脂酶. 将AtPLC6的编码区序列插入原核表达载体后进行了原核表达, 纯化的AtPLC6重组蛋白可水解PIP2产生IP3和DAG, 且水解活性呈明显的钙依赖特性, 反应的最适Ca²⁺浓度为10 μmol/L. Northern分析结果表明, 在检测的根、茎、叶、花、果和幼苗中均有AtPLC6 mRNA的转录, 但转录水平较低. 用ABA, NaCl, 冷和热等胁迫处理的实验表明, AtPLC6 mRNA的转录受到冷胁迫的诱导, 而受ABA, NaCl和热等胁迫影响较小, 推测AtPLC6可能参与了植株对冷胁迫的响应.     

番茄ACC合成酶基因Le-ACS6启动子的结构分析

乙烯对高等植物的生长发育具有重要的调控作用, 而Le-ACS6是控制番茄果实发育过程中第1系统乙烯合成的关键酶, 其基因表达受乙烯的负反馈调节. 利用5′系列缺失的Le-ACS6启动子与报告基因LUC的融合基因以微粒轰击法瞬时转化番茄果实, 发现Le-ACS6启动子中ATG上游-347 ~ -266区域可能含有与响应乙烯负调控相关的顺式作用元件. 分别以全长和缺失-347 ~ -266区域的Le-ACS6启动子与报告基因GUS构建融合基因, 利用农杆菌介导的方法稳定转化微型番茄Micro-Tom. 结果表明, -347 ~ -266区域缺失的Le-ACS6启动子所驱动的GUS表达不再受外源乙烯的抑制.     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

西藏喜马拉雅冷杉年轮δ 13C与气候意义

对采自青藏高原东南部林芝地区的喜马拉雅冷杉进行交叉定年后, 分析了喜马拉雅冷杉年轮 δ ¹³C序列与气候要素之间的关系. 去除大气CO₂浓度升高导致大气CO₂中δ ¹³C下降和生长趋势的影响后, 建立树轮δ ¹³C值的残差序列Δ¹³C. 利用附近林芝气象站的气象资料, 分析了树轮Δ^{13C序列对气候要素的响应. 结果表明: 冷杉δ 13C的高频振荡与该地区前一年的9～11月降水和相对湿度存在较好的相关性, 并存在强的滞后效应. 通过建立回归方程重建了该区域的秋季(9～11)月相对湿度序列, 解释方差达37.9%. 重建相对湿度序列表明1800年前相对湿度变化周期较短、变幅较小, 1800～2000年则相反.}