一氧化氮参与茉莉酸诱导蚕豆气孔关闭的信号转导

用一氧化氮(NO)特异性荧光探针DAF-2DA结合激光共聚焦显微技术证明蚕豆气孔保卫细胞中存在NO. 从以下几个方面证明NO可能参与JA调控气孔运动的信号转导过程: (ⅰ) 外源JA促进叶片气孔保卫细胞NO的合成; (ⅱ) JA和NO都能够诱导气孔关闭, 并具有浓度效应; (ⅲ) 低浓度的NO和JA之间在诱导气孔关闭上存在一定的加合效应; (ⅳ) NO的清除剂PTIO可大大减弱JA诱导蚕豆气孔关闭的作用, 一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME能够抑制JA 诱导的蚕豆气孔关闭效应, 也可以抑制JA诱导保卫细胞中NO的产生. 推测JA处理诱导保卫细胞中NO的产生主要来源于NOS合成途径.     

NO参与真菌诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL活化和紫杉醇生物合成的促进作用

由桔青霉(Penicillium citrinum)细胞壁制备的诱导子可以诱发红豆杉悬浮细胞产生多种防卫反应, 包括NO合成、PAL活化和紫杉醇合成加强. NO淬灭剂cPTIO和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU可以阻断桔青霉诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL活化和紫杉醇合成的促进作用. NO供体SNP单独处理也可以触发红豆杉细胞中PAL活化和紫杉醇合成加强. PBITU可以抑制桔青霉诱导子诱发红豆杉悬浮细胞中NO的增加. 实验结果证实了在桔青霉诱导子处理下红豆杉悬浮细胞中NO合成与PAL活化和紫杉醇合成加强之间的因果关系, 表明桔青霉诱导子诱导红豆杉悬浮细胞通过NOS产生NO, NO作为信号分子活化PAL并触发紫杉醇生物合成.     

一氧化氮通过依赖和不依赖活性氧的信号途径介导桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉悬浮细胞中紫杉醇生物合成

一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)是植物体内两种常见的信号分子, 在植物抗逆反应等过程中起重要作用. NO合成和氧化迸发(oxidative burst)以及ROS积累是红豆杉悬浮细胞在桔青霉细胞壁诱导子处理下出现的两个早期反应. 为了探讨NO和ROS在桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉细胞紫杉醇合成过程中的作用及其相互关系, 分别以NO专一性淬灭剂cPITO, 一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU, 质膜NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI以及超氧离子(O₂^-)和过氧化氢(H₂O₂)淬灭剂超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)处理红豆杉细胞. 结果表明, cPITO和DPI不仅可以分别抑制红豆杉细胞的NO合成和ROS积累, 同时还可以阻断诱导子对紫杉醇合成的促进作用, 说明NO和ROS是参与桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉细胞中紫杉醇合成调控的信号分子. cPITO和PBITU同时还可以部分抑制诱导子对红豆杉细胞氧化迸发的诱发作用. 外源NO单独处理可以促进红豆杉细胞中紫杉醇合成, DPI可以抑制NO对紫杉醇合成促进作用. 然而, 即使在红豆杉细胞中ROS积累被完全抑制的情况下, NO和桔青霉细胞壁诱导子对细胞中紫杉醇的合成仍然具有一定的促进作用. 上述结果表明, NO可以通过依赖和不依赖ROS的两类不同信号途径介导真菌诱导子诱发红豆杉细胞中紫杉醇的生物合成. 实验结果同时也表明, NO和桔青霉细胞壁诱导子对红豆杉细胞中紫杉醇合成的促进作用可以被CAT抑制, 但不受SOD的影响, 说明氧化迸发产生的H₂O₂可能是介导NO和桔青霉细胞壁诱导子诱发紫杉醇合成的信号分子.     

蚕豆气孔保卫细胞中的NOS类蛋白定位及其功能分析

利用免疫荧光显微镜技术和免疫胶体金标记技术确定蚕豆气孔保卫细胞中存在一氧化氮合酶(NOS)类似蛋白, NOS主要分布在气孔保卫细胞的细胞核、细胞质、叶绿体、线粒体以及细胞壁上. 局部灼伤和外源茉莉酸(JA)都能提高蚕豆叶片和表皮NOS活性和一氧化氮(NO)水平, NOS的活性变化与叶片中的NO的变化趋势基本一致; NOS抑制剂L-NAME可抑制JA诱导的NO水平的增加. 由此推测, NOS途径是伤胁迫和JA诱导形成NO的主要途径. 药理学实验表明适当增加Ca²⁺浓度能够提高叶片NOS的活性和NO的水平, 说明蚕豆叶片NOS活性和NO的分布具有一定的钙依赖性. 保卫细胞中NOS及其催化形成的NO可能通过对气孔运动的调节参与植物对逆境的响应.     

拟南芥保卫细胞微管骨架的重排参与NO诱导的气孔关闭

以GFP:α-tubulin-6转基因拟南芥为材料, 利用药理学实验及激光扫描共聚焦显微技术研究了微管骨架在NO诱导气孔关闭过程中的动态变化及其可能的调控机制. 结果表明: (ⅰ) 微管特异性抑制剂长春花碱和NO供体SNP均能诱导气孔关闭, 并且长春花碱能加强SNP对气孔开度的抑制作用, 而微管稳定剂紫杉醇则部分抑制了NO对气孔关闭的诱导作用; (ⅱ) 开放气孔保卫细胞中, 大量周质微管从保卫细胞的背壁向腹壁呈辐射状整齐规则地排布, 并且几乎所有微管纤维都与保卫细胞腹壁成90°垂直; (ⅲ) 同一条件下保卫细胞经外源NO供体SNP光下处理30 min, 保卫细胞内整齐的辐射状微管逐步散乱, 微管部分解聚, 纤维数量减少, 部分交错扭曲, 排布方式也由与腹壁垂直转变为倾斜, 说明微管骨架可能参与了NO诱导的气孔关闭; (ⅳ) 进一步研究发现, 胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM可以大幅度削弱由NO诱导的气孔关闭作用, 而对长春花碱诱导的气孔关闭无明显影响; 开放气孔的保卫细胞经SNP处理后, 再施加BAPTA-AM, 散乱的微管骨架排布随处理时间延长逐步趋于正常, 到30 min时基本恢复成辐射状, 与对照相比无明显区别, 表明在NO对微管排布的调节机制中有Ca²⁺参与. 综合以上结果推测, 在NO调控的气孔运动中, NO可能是通过调节胞内Ca²⁺来促进微管骨架系统的重排, 进而影响气孔的开关运动.     

一氧化氮参与水杨酸对蚕豆气孔运动的调控

研究了一氧化氮(NO)在水杨酸(SA)诱导蚕豆气孔运动中的作用. 结果表明, 在一定范围内, SA和NO都可诱导气孔关闭. 100 mmol/L SA能够提高保卫细胞胞质中NO的水平, NO清除剂和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂都能够降低SA引起的胞质NO的增加. 同时, NO的清除剂PTIO和NOS的抑制剂L-NAME几乎能够完全抵消SA诱导气孔关闭的效应. 推测SA通过NOS途径诱导形成NO, 进而诱导气孔关闭. 鸟氨酸环化酶的抑制剂ODQ和 cADPR的拮抗剂烟碱能够减弱SA和NO诱导气孔关闭的作用. 表明在SA和NO诱导气孔关闭的过程中可能需要有cGMP和cADPR介导.     

一氧化氮介导非亲和性激发子诱发水稻悬浮细胞过敏反应

98-186-1G1与97-23-2D1分别是水稻“秀水”品种的非亲和性与亲和性稻瘟病小种. 由98-186- 1G1细胞壁制备的激发子称为非亲和性激发子(IE), 可以诱导“秀水”悬浮细胞的过敏反应, 包括NO产生、PAL酶活性的升高、抗性相关基因pal, pr1与chi转录强度的增加以及水稻的过敏性死亡. 而由97-23-2D1细胞壁制备的激发子称为亲和性激发子(CE), 它不能有效地诱导“秀水”悬浮细胞NO水平的升高以及上述抗性相关基因转录水平的提高. 一氧化氮合成酶(NOS)的抑制剂L-NAA, PBITU以及NO的猝灭剂CPTIO可以抑制IE诱导的细胞过敏性死亡、PAL酶活性增加以及抗性相关基因转录强度的增加. NO的供体SNP直接处理“秀水”悬浮细胞也可以诱导pal, pr1与chi的转录. 这些结果表明, NO可以作为一种信号分子介导IE诱导的“秀水”过敏反应, 而且只有NO与H₂O₂联合作用才能介导IE诱导的过敏性死亡.     

内皮细胞舒血管因子的发现者——弗奇戈特

一氧化氮(NO)是一种无色、无味的气体,曾被认为是一种可造成烟雾和酸雨的大气污染物,然而1980年代开始.大量研究显示NO是一种内源性信号分子,在血管平滑肌舒张、血液流动调节、炎症发生、细胞生长和长期记忆等方面都发挥着关键性的作用,以至于1994年美国<科学>周刊将NO评为当年的明星分子.NO作为内源性信号分子的发现不仅成功解释了许多生命现象的分子机理和药物的作用机制,而且在疾病治疗和诊断领域也取得了巨大成功.     

一氧化氮自旋探针的合成和反应特性

一氧化氮(NO)是调节神经、心血管、内分泌和免疫系统非常重要的细胞信使分子.NO的研究不仅可以阐明许多生理现象,而且可能为许多疾病的防治提供新的途径和手段.但是,对生物体系NO的检测,目前所采用的方法均有一定的缺陷,如灵敏度不高、特异性不强等.因此,建立一种快速、简便、灵敏和高专一性的可定量分析生物体系中NO的方法十分重要.Joseph和Hans-Gert等人曾用氮氧自由基和环状化合物与NO作用检测NO,但因反应速度太慢和只有6％的捕捉效率未能付诸应用,我们根据有机化合物结构理论,设计、合成了一系列的咪唑类NO自旋探针Ⅰ,利用电子自旋共振(ESR)波谱方法考察了自旋探针的取代基效应,初步建立了一套测量微量NO的方法.目前,可检测到5×10~(-12)摩尔的NO,而且有很强的专一性,不受超氧自由基和羟基自由基的干扰,亦不受介质的pH和盐浓度的影响.     

一氧化氮的心血管生物学作用

一氧化氮(NO)是重要的细胞信使物质,它参与心血管活动的调节,许多心血管疾病与一氧化氮生物学功能紊乱有关,深人研究一氧化氮的生物学作用将会给心血管疾病的临床治疗提供新的思路。     

小鼠腹腔抑制性巨噬细胞免疫调变涉及ERK1/2和p38 MAPK的激活与NO的生成？

探索了脂多糖（LPS）介导的小鼠腹腔抑制性巨噬细胞免疫调变的机理。通过对LPS调变巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS)mRNA与iNOS蛋白表达以及一氧化氮（NO）产生的研究,分析了p38MAPK和ERK1／2信号分子的特异性抑制剂SB203580和PD98059对NO代谢途径和调变巨噬细胞功能的影响。实验证明,免疫调变巨噬细胞对K562肿瘤细胞的细胞静止效应似乎不依赖ERK1／2,p38MAPK信号通路和NO的产生,而对淋巴细胞的增殖效应却与ERK1／2,p38 MAPK和NO的产生密切相关。     

NO 介导的H2S 合成参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

以拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 野生型和突变体为材料, 利用激光共聚焦显微技术、实时定量PCR 和分光光度法, 结合药理学实验, 探讨两种气体信号分子硫化氢 (hydrogensulfide, H₂S) 和一氧化氮 (nitric oxide, NO) 在乙烯 (ethylene, Eth) 调控气孔运动中的相互关系. 结果表明, H₂S 合成抑制剂能明显抑制乙烯诱导的拟南芥气孔关闭; 乙烯能够显著增加拟南芥叶片的H₂S 含量, 提高L-/D-半胱氨酸脱巯基酶 (磷酸吡哆盐依赖性酶) (L-/D-cysteinedesulfhydrase, L-/D-CDes) 活性及AtL-CDes 和AtD-CDes 的转录水平; 清除NO 可减弱乙烯的诱导效应; 乙烯亦可明显诱导Atnoa1 突变体叶片H₂S 的积累, 但对Atnia1,nia2 突变体没有明显作用; H₂S 合成抑制剂对乙烯诱导气孔保卫细胞和叶片的NO 水平升高以及硝酸还原酶(nitrate reductase, NR) 活性增强没有明显影响, 同样乙烯可以诱导Atl-cdes 和Atd-cdes 突变体保卫细胞NO 水平升高, 说明H₂S 和NO 均参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭, 且NO 可能位于H₂S 上游参与调控这一信号通路.     

大丽轮枝菌毒素对棉花悬浮细胞NO和H2O2的产生和GST基因表达的影响

一氧化氮(NO)和过氧化氢(H₂O₂)是重要的信号分子, 参与调控植物的各种生理过程, 特别是在诱导植物防卫基因表达中有重要作用. 本文主要研究NO和H₂O₂是否参与棉花抗大丽轮枝菌毒素(VD-toxins)的抗性反应以及其对GST基因表达的调控作用. 结果表明, NO和H₂O₂信号参与棉花细胞抗大丽轮枝菌毒素的信号途径, 从而诱导抗性反应. NO和H₂O₂信号可能协同作用, 但不相互依赖. GST基因在棉花悬浮细胞抗大丽轮枝菌毒素抗性反应中起重要作用. NO对GST基因表达的调控不依赖H₂O₂, H₂O₂对GST基因表达的诱导作用更强.     

胞质pH变化介导乙烯诱导的拟南芥保卫细胞NO产生和气孔关闭

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料, 用药理学实验、激光共聚焦显微技术和分光光度法研究了保卫细胞胞质pH和一氧化氮(nitric oxide, NO)在乙烯(ethylene, Eth)调控气孔运动信号转导中的作用. 结果表明, 乙烯利和乙烯前体物ACC都能够引起保卫细胞内胞质pH和NO的水平升高; 弱酸(乙酸)以及质膜H+-ATP酶的抑制剂钒酸钠可以逆转乙烯诱导的拟南芥气孔关闭, 同时减弱乙烯所引起的NO含量增加和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)活性的增强; 而NO清除剂cPTIO对胞质pH无显著影响. 可以推测, NO和pH均参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭作用, 且胞质pH的变化(主要由质膜H⁺-ATPase引起的)可能位于NO (主要由NR途径产生)上游介导这一过程.     

内源性一氧化氮与一氧化碳在大鼠低氧性肺动脉高压发病中的相互作用

研究一氧化氮合酶（nitric oxygenase,NOS)/一氧化氮（nitric oxide,NO)系统和血红素加氧酶（heme oxygenase,HO)/一氧化碳（carbon monoxide,CO)系统在低氧性肺动脉高压发生机制中的作用及其相互关系。采用大鼠低氧性肺动脉高压模型，分别观察HO抑制剂锌原卟啉－9（zinc protoporphyrin IX,ZnPPIX)对肺动脉压力、体内CO含量、NO含量、NOS表达的影响，以及NOS抑制剂N^ω－硝基－L－精氨酸甲酯（N^ω－nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对肺动脉压力、体内NO含量、CO含量、HO－1表达的影响。结果显示随低氧性肺动脉高压的形成，肺组织匀浆NO含量及各肺动脉内皮细胞eNOS表达较对照组降低；ZnPP-IX的干预明显降低的了体内CO含量，此时低氧大鼠肺动脉压力较单纯低氧时更为显著，而肺组织匀浆NO含量及各级肺动脉内皮细胞eNOS表达较低氧组明显增加（P均＜0．01）。低氧性肺动脉高压形成时大鼠肺组织匀浆CO含量及各级肺动脉平滑肌细胞HO－1表达较对照组增加；L－NAME的应用明显减少了体内NO含量，此时低氧大鼠肺动脉压力较单纯低氧时更为显著，而肺组织匀浆CO含量及各级肺动脉平滑肌细胞HO－1表达及低氧组相比明显降低（P均＜0．01）。结果揭示内源性NOS／NO与HO／CO系统既相对独立又相互作用，以网络调节的方式共同参与低氧性肺动脉高压形成的调控机制。     

用ESR检测过氧亚硝基氧化二甲基亚砜产生的甲基自由基

NO在体内具有重要的生物功能,如能防治血小板的凝聚,它是内皮细胞松弛因子(EDRF),又是神经传导的逆信使,在学习和记忆过程起着重要作用.但是它还是自由基,因而它化学性质活泼,反应性强,具有细胞毒性作用,在免疫杀伤过程中发挥着重要作用.最近研究发现,细胞在产生 NO 的同时,也产生超氧阴离子自由基.NO和超氧阴离子自由基具有非常高的反应速率常数(6.4×10~9mol~(-1)·s~(-1)),反应形成过氧亚硝基(ONOO~-).这是一种氧化性极强的物质,可氧化细胞膜脂和蛋白质的硫氢基,导致细胞损伤和疾病的发生.在碱性条件下,过氧亚硝基比较稳定,一旦质子化,立即分解产生类羟基和NO_2自由基.试验表明,在很多病理状态发生此反应,因而对过氧亚硝基的研究非常引人关注.但是过去的研究多是用ONOO~-氧化二甲基亚砜(DMSO)产生的醛类物质作为检测对象进行研究的.而ONOO~-损伤细胞成分很多是通过自由基机理的.还没有发现直接检测ONOO~-氧化反应产生自由基的报道.本文用自旋捕集技术直接捕捉到了 ONOO~-氧化 DMSO 产生的自由基.并且通过波谱解析和计算机模拟证明是甲基自由基.还利用这个自由基产生体系研究了一些抗氧化剂对甲基自由基的清除作用和对ONOO~-氧化活性的抑制作用.     

一氧化氮对拟南芥保卫细胞内向钾通道的作用

研究了一氧化氮(NO)对拟南芥保卫细胞内向钾通道的作用. 当细胞内液不含钙的络合剂EGTA(Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)时, NO抑制内向钾通道电流; 当细胞内液含有EGTA时, NO对内向钾通道电流没有明显作用. NO还抑制拟南芥叶片气孔的开放; 当NO和EGTA共同处理叶片时, 气孔开放与对照相比不受抑制. 先前有报道NO能激活保卫细胞质膜钙通道. 由此推测, NO通过激活质膜钙通道引起胞内钙含量升高, 从而抑制内向钾通道电流, 抑制气孔开放.     

碳烟与气态和吸附态NO_2反应的不同机制

在K/MgAlO催化剂上测试了气态及吸附态NO2与碳烟(soot)的反应,结合原位红外表征和第一性原理计算确认了反应中间物,对两类反应的差异进行了机理解析.结果表明,吸附态NO2的活性弱于气态NO2.吸附态NO2以硝酸盐的形式参与反应,导致出现了2个红外特征峰2234和2110 cm-1,分别归属为K位上的氰酸离子和MgAlO载体上的氰离子.此外,气态NO2的反应中间物异氰酸离子也得到证实.吸附态NO2(即硝酸盐)的反应受到K+静电场的束缚,倾向于形成氰酸离子,氰酸离子易裂解成氰离子迁移到载体上;气态NO2与碳烟反应则倾向于形成相对稳定的异氰酸离子.吸附态NO2较弱的低温活性可归因于K+静电场的束缚.     

血红素加氧酶催化产生的CO参与ABA诱导的蚕豆气孔关闭及其信号转导

一氧化碳(CO)是哺乳动物中新发现的一种重要的生物活性/信号分子, 其生物学效应往往通过一氧化氮(NO)和环鸟苷酸(cGMP)信号介导. 本研究发现, 可引起蚕豆叶片气孔关闭的ABA处理能诱导蚕豆叶片CO释放的增加以及CO合成酶血红素加氧酶(HO)活性的提高; 同时, ABA诱导的蚕豆气孔关闭也可以被CO合成酶抑制剂ZnPP和CO/NO清除剂血红蛋白(Hb)部分阻断. 进一步的研究表明, 外源添加CO供体高铁血红素(Hematin)和CO水溶液不仅能促进CO的释放, 还能以依赖于时间进程的形式诱导蚕豆气孔的关闭, 后者与NO供体SNP处理的结果相类似; NO合成酶硝酸还原酶(NR)的抑制剂钨酸钠(Tungstate), NO专一性清除剂cPTIO, ZnPP和Hb不同程度地逆转了这一过程. 在4 h的处理过程中, SNP, 0.01%饱和度的CO水溶液以及Hematin明显地激发了NO的产生; 反之, 结合cPTIO或Tungstate处理后, NO的荧光信号几乎被完全抑制. 此外, 鸟苷酸环化酶(GC)的抑制剂ODQ阻断了CO诱导的气孔关闭, 而ODQ的作用又被cGMP的类似物8-Br-cGMP所逆转. 上述结果暗示, HO产生的CO可能参与了ABA诱导的蚕豆气孔关闭, NO和cGMP则是CO信号通路的下游分子.     

一氧化碳诱导绿豆下胚轴不定根的发生

研究了一氧化碳(CO)在绿豆下胚轴插条不定根发生中的调控作用. 结果表明, 与NO相类似, CO供体高铁血红素(Hematin)以浓度和时间依赖性诱导绿豆下胚轴的不定根发生, 不同浓度的CO气体饱和溶液也具有诱导作用. 此外, CO清除剂血红蛋白(Hb)和合成专一性抑制剂ZnPPIX, 抑制生长素极性运输的NPA以及一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME均能不同程度地逆转CO供体对绿豆下胚轴不定根发生的诱导作用; CO处理36 h后NO荧光信号有明显的增强趋势, 并主要分布在维管束, NO专一性清除剂cPTIO对CO诱导的NO荧光有抑制作用, 推测CO可能主要通过NOS途径来合成NO, 进而诱导绿豆下胚轴的不定根发生.