FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系sosp9607的影响

设计筛选针对人cyclin E分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对骨肉瘤细胞系Sosp9607胞内cyclin E分子表达水平的影响.首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与cyclin E分子真核表达载体共同转染293T细胞.挑选出最有效抑制cyclin E表达的序列,应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因cyclin E的siRNA慢病毒载体pLKO-CE.使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收获病毒上清,感染Sosp9607细胞系,对病毒感染后抑制cyclinE表达的效果进行检测.结果在4条针对cyclin E分子设计的siRNA序列中,siRNA-464最为有效的抑制了外源性cyclin E分子的表达;带有该序列的慢病毒载体pLKO-CE可以完全抑制Sosp9607细胞中天然分子的表达,引起Sosp9607细胞生物学行为的改变:G1期细胞增多,S期减少,细胞增殖受抑制.说明应用基因工程技术成功构建了针对cyclin E分子的RNA干扰慢病毒载体,可有效抑制骨肉瘤细胞cyclin E的表达,使肿瘤细胞增殖减缓,为深入研究针对cyclin E的基因治疗方案的临床前实验研究提供了实验证据和理论依据.     

荧光定量PCR法在人类宫颈癌RNA干扰中的应用

研究荧光定量PCR法在RNA干扰（RNAi）技术抑制宫颈癌Caski细胞人乳头瘤病毒16型E6基因（HPV16E6）的应用情况,并与传统使用的灰度值分析法进行比较。构建shRNA重组质粒干扰载体转染至Caski细胞中。通过荧光定量PCR法和灰度值分析法检测干扰后细胞HPV16E6基因的mRNA及蛋白质表达水平。实验表明HPV16E6基因mRNA及蛋白质的表达量都有明显降低,与阴性对照空白质粒组相比有显著差异（P〈0．01）;RNAi对宫颈癌Caski细胞中HPV16E6基因的表达具有较高的抑制率;荧光定量PCR法较之传统的灰度值分析法更为准确。     

siRNA干扰Survivin基因对结肠癌生物学特性影响

向结肠癌SW480细胞中导入针对Survivin基因的siRNA,研究RNA干扰对SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据,同时寻求新的、有效的RNA干扰片段.设计3条特异性干扰靶向Survivin基因的siRNA,转染24,48,72h后,Western蛋白印迹法检测Survivin蛋白变化,同时噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.3条siRNA分别作用于SW480细胞,转染24,48,72h后,3组Survivin蛋白表达均出现下调(P<0.05),在48h时达到顶峰,抑制率分别为66.5%±2.1%,49.6%±2.8%和47.8%±3.1%,差异具有统计学意义(P<0.05);MTT法显示Survivin基因沉默后,细胞增殖受到明显抑制.脂质体所介导的体外Survivin siRNA,能有效地沉默结肠癌细胞的Survivin基因,从而抑制结肠癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡,特别是针对保守区域设计的靶向siRNA.干扰效果更为显著.     

SARS-CoVS基因表达及纯化

严重急性呼吸道综合症是由一种新的冠状病毒SARS-CoY引起的．作者通过PCR扩增得到了S蛋白的6个编码片段，并利用表达载体pET28a( )在E．coli BL21中进行了原核表达．通过亲和层析纯化了包含大部分ACE2结合区域的S蛋白片段(S4)．ELISA分析结果表明S4与SARS病人恢复期血清具有良好的反应能力．     

eIF4E在非小细胞肺癌耐药性中的作用

探讨eIF4E对厄洛替尼耐药细胞株细胞增殖的影响及作用机制.在配对的厄洛替尼敏感和耐药细胞株(HCC827-EP、HCC827-ER)上,采用实时定量PCR检测mRNA水平的变化,Western Blot检测蛋白水平的变化;通过SRB检测细胞的生长和药物的抑制率的变化.以及用脂质体转染eIF4E的小干扰RNA,用上述方法检测多种信号分子mRNA、蛋白水平的变化,及对细胞生长和对药物抑制率的影响.结果显示,与HCC827-EP相比,eIF4E在HCC827-ER上高表达;HCC827-ER转染eIF4E siRNA的细胞生长速度明显减慢,从第3 d起差异具有统计学意义(P0.05),在相同浓度的厄洛替尼作用下,转染eIF4E siRNA的细胞具有更高的抑制率,差异具有统计学意义(P0.05).结论:下调eIF4E的表达能够增强厄洛替尼对NSCLC的抑制作用,eIF4E的高表达参与了厄洛替尼获得性耐药的产生.     

干扰大鼠背根神经节MrgC受体mRNA的实验研究

大鼠MrgC受体与人的MrgX1受体有相似特性,但至今尚无MrgC受体的拮抗剂,阻碍了对其功能的研究.将大鼠的背根神经节(DRG)进行体外培养,加入小分子片段RNA(siRNA)对MrgC受体进行干扰.干扰时间为4 h,24 h之后再重复干扰1次.结果显示干扰后DRG中MrgC受体的mRNA表达减少84%,表明该分子片段RNA能有效使MrgC受体基因"沉默".     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞药物泵P-gp及LRP蛋白表达的影响

目的:用补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,观测药物泵P-gp及LRP的表达,并同小干扰RNA片段(siRNA)靶向切除P-gp、LRP基因后对这两种蛋白表达的影响相比较.方法:补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,设计并合成针对P-gp、LRP基因对应序列的siRNA,采用转染试剂对细胞进行转染.两种蛋白实验分组均为:空白对照组、含药血清处理组及siRNA处理组.采用RT-PCR检测P-gp及LRP mRNA,免疫细胞化学法检测蛋白表达及定位,WB检测蛋白表达.结果:补中益气汤含药血清可以降低两种药物泵的表达,效果同siRNA类似,具有统计学差异(P0.05).结论:补中益气汤含药血清能降低A549/DDP细胞上P-gp和LRP的表达.     

siRNA沉默survivin增强hNIS转染的鼻咽癌细胞株对~(131)碘的敏感性

目的:研究Survivin特异性小片段干扰RNA(siRNA)能否增强人钠碘同向转运体(hNIS)转染的鼻咽癌细胞株(CNE-2-hNIS)对131碘的放射敏感性.方法:设计并合成针对survivin基因的特异性siRNA,利用脂质体法转染CNE-2-hNIS细胞,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和Westernblot方法检测细胞survivin基因沉默效果.CCK-8、克隆形成实验和Annexin VFITC/PI双染流式细胞仪检测131碘孵育后对细胞增殖和凋亡的影响.结果:SurvivinsiRNA转染CNE-2-hNIS细胞72h后,细胞的survivin基因mRNA和蛋白表达明显降低,Si-survivin组较SiRNA-NC组细胞增殖率降低,131碘孵育后,Si-survivin组较SiRNA-NC组细胞增殖率降低,凋亡率增高,差别有统计学意义(P0.05).结论:Survivin特异性siRNA能显著沉默CNE-2-hNIS细胞的survivin基因的表达,增加CNE-2-hNIS对131碘的放射敏感性.     

Hela细胞中突变PSF蛋白对细胞增殖迁移及可变剪接的影响

PSF作为真核细胞中的抑癌蛋白,在Hela细胞发生基因突变导致其蛋白功能改变.为了阐明突变体PSF蛋白在肿瘤细胞的作用,本文分别采用siRNA干扰、细胞生长曲线、细胞划痕等实验检测muPSF对Hela细胞增殖及迁移的影响,半定量PCR实验分析PSF调控的下游靶基因的可变剪切情况.研究结果显示,当通过siRNA干扰muPSF的表达后Hela细胞的增殖迁移能力下降,高表达突变体PSF可增强Hela细胞的增殖与迁移,半定量PCR实验分析PSF下游调控基因显示muPSF可以改变增殖和迁移相关基因的可变剪接形式.因此,我们的实验证明,Hela细胞中muPSF通过调控下游靶基因的可变剪切影响Hela细胞的增殖和迁移能力.     

siRNA对肺癌细胞株NCI-H460 bcl-2基因表达的影响

目的:研究siRNA (smallinterferenceRNA)对大细胞肺癌细胞株NCI -H4 6 0bcl- 2基因表达的影响。方法:利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl - 2基因为靶标的siRNA ,通过脂质体将合成的siRNA转入NCI-H4 6 0细胞株,设置转染bcl- 2反义药物G3139和空白两对照组。用MTT法检测siRNA对细胞生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期的改变和Bcl- 2蛋白表达;RT -PCR检测bcl- 2mRNA水平。结果:siRNA组与对照组细胞存活率均有显著性差异(P <0 0 5 ) ;siRNA组bcl- 2的mRNA明显低于对照组和反义组(P <0 0 5 ) ;siRNA组Bcl- 2蛋白阳性率明显低于对照组和反义组,siRNA组以及反义组细胞阻滞于S期。结论:体外转录合成的siRNA可抑制NCI-H4 6 0细胞bcl- 2基因的表达,抑制率可达5 0 %以上。     

在Hep G2细胞中利用siRNA沉默GFP基因的实验探讨

目的:通过探讨小分子双链RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)机制沉默肝癌细胞株Hep G2荧光素报告基因GFP的各项生物学指标,为进一步实验和临床研究提供依据.方法:通过体外实验,对siRNA和siRNA脂质体的稳定性和细胞毒性进行评估;通过荧光标记技术,研究不同时间siRNA脂质体的转染效率;通过荧光显微镜下观察转染细胞和RT-PCR检测靶基因mRNA表达,确定不同种类、形式、剂量的siRNA对靶基因的沉默效能.结果:在空白培养液中,siRNA和siRNA脂质体可稳定至4h,在5%血清中2～4h后明显降解;100nM的siRNA和siRNA脂质体无明显细胞毒性;siRNA脂质体转染细胞株的效率随时间不同而不同,4h可达90%;非特异性siRNA/脂质体无沉默靶基因表达作用,特异性siRNA/脂质体对靶基因的沉默作用在一定范围内随剂量升高(20nM、50nM、100nM)而升高.结论:siRNA的稳定性可满足实验需要,且无明显细胞毒性,特异性siRNA转染肝癌细胞株能有效抑制靶基因表达,用脂质体转染可提高转染效率.siRNA通过RNAi机制沉默靶基因表达,为肿瘤的治疗和基础研究提供了新的工具和思路.     

敲低EYA3基因抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长

为了探讨人眼缺失基因(EYA3)在人视网膜母细胞瘤发生发展中的生物学作用,构建了EYA3小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体,并验证敲低效果和观察其对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响.根据人EYA3的cDNA序列,将设计含有小发卡结构的寡核苷酸序列克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染HEK293T细胞中,通过实时定量RT-PCR及Western印迹检测EYA3基因的表达水平;重组质粒稳定转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞并利用生长曲线检测EYA3对其生长的影响.结果表明:构建的siRNA能够抑制EYA3基因的表达,生长曲线验证EYA3 siRNA基因能抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长.最后结论是EYA3 siRNA能够抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在视网膜母细胞瘤中的功能奠定了基础.     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

eIF4E在CXCL12诱导的胃癌转移中的作用和机制

探讨e IF4E在CXCL12诱导胃癌细胞形态学改变和迁移中的作用和机制.在胃癌细胞株(SGC7901,MGC803)上给予CXCL12处理,显微镜下观察细胞形态的改变;通过transwell实验检测CXCL12对胃癌细胞迁移能力的影响;在SGC7901上给予CXCL12处理,用Western blot检测e IF4E磷酸化和总蛋白水平的变化;用脂质体转染e IF4E的小干扰RNA,检测e IF4E对胃癌细胞形态学和迁移的影响;以及用qRT-PCR检测与肿瘤侵袭转移密切相关的因子MMP9的mRNA水平的表达.结果显示,给予CXCL12处理,胃癌细胞形态由上皮表型向长梭形的间叶样表型转变,细胞的迁移能力提高.在相同浓度的CXCL12处理情况下,转染e IF4E siRNA抑制e IF4E的表达,可抑制CXCL12诱导的细胞的形态学改变和迁移能力.另外,CXCL12引起与肿瘤转移密切相关因子MMP9的mRNA水平的表达升高,而用siRNA抑制e IF4E的表达,可下调MMP9的mRNA表达水平.结论:CXCL12激活了e IF4E,阻抑e IF4E的表达抑制CXCL12诱导的形态学改变和细胞迁移,其作用机制可能与上调MMP9的表达有关.     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

风疹病毒E1抗原基因片段的拼接及原核表达

应用基因克隆技术,对风疹病毒E1抗原基因片段进行拼接及克隆表达．根据软件GOLDKEY预测E1抗原的主要抗原决定簇位点E1(243～286aa),再设计4条近60个碱基长引物,利用PCR仪延伸合成目的基因,酶切并构建重组表达载体,酶切与测序鉴定,再转化表达菌株BL21(pLYS),IPTG诱导表达,行SDS-PAGE检测到目的基因表达成功．结果实现了用基因克隆技术将含E1(243～286)片段的pETKDO载体向大肠杆菌的转化,IPTG诱导2h,获得的表达量高。