RNA干扰技术在植物遗传特性改良中的应用研究

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一项新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA(double-strands RNA,dsRNA)在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。RNAi现象广泛存在于生物体中,是2l世纪的研究热点之一。目前,RNAi及相关沉默反应的机制在植物中的研究取得了重大进展,RNAi已发展成为一种强有力的实验工具,用来控制植物目的基因的表达以获取预期的生物表型,具有广阔的应用前景。在此对RNAi在植物遗传特性改良的研究现状进行概述,以期为RNAi技术在植物上的深入研究提供参考。     

果蝇血液标记基因srp原核表达质粒构建及多克隆抗体制备

果蝇基因srp是血液发育的早期标记基因,为了研究果蝇这一模式动物中血液发育的详尽过程,通过提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,设计引物克隆出srp基因,将所得片段插入原核表达载体pET28a中,经酶切和序列鉴定,成功构建重组质粒,并通过IPTG诱导表达出His-srp融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯...     

HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过Western Blot技术检测Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480细胞系,采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后,通过RT-PCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平,经长达60 d的传代,最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系,为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.     

拟南芥同源转换盒基因A21反义RNA基因重组体的构建及转化

A21是拟南芥的一同源转换盒基因,以发育旺盛的组织中高度表达。采用反义RNA技术,将该基因cDNA 5′端自然410bp反向克隆到pTA7002后,构建了可在植物中调控表达A21反义RNA基因片段的重组体。以根癌农杆菌浸渍法将重组体转入拟南芥Landsberg erecta生态型植株中,筛选到转A21反义RNA基因的拟南芥植株。反义基因可在甾类激素诱导下表达出A21的反义RNA。经初步诱导表达,变异性状表现为顶端生长抑制型。     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭（Anas platyrhynchos domesticus）和绿头野鸭（Anas platyrhynchos）卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA（同源性为96%）、褐家鼠睾丸cDNA（同源性为83%）有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.     

跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测

"跨界基因沉默"是一种利用大肠杆菌在哺乳动物细胞中传递小干扰RNA并引起基因沉默的新颖技术,具有实用、稳定和低成本等优点.该技术通过构建一种能转录出短发夹RNA(shRNA)的大肠杆菌,而这种大肠杆菌产生的shRNA能靶向哺乳动物细胞中的特定基因,从而引发RNA干扰(RNAi).本文用RecA同源重组的方法将跨界基因沉默质粒的工作元件快速地整合到大肠杆菌的染色体DNA上,构建了跨界基因沉默菌株.通过吖啶橙染色实验证明了跨界基因沉默菌株能够入侵哺乳动物细胞,最后Western blot结果表明跨界基因沉默菌株可以对靶标基因产生干扰作用.该技术的完善将进一步促进工程菌的研发和利用.     

RNA干扰的机制与应用

RNAi是双链RNA介导的一种基因沉默 .通过对果蝇、线虫、真菌及植物的研究 ,RNAi的机制逐渐被证实 .Dicer切割产生的小干扰片断在RNAi过程中发挥主要的作用 .现在 ,越来越多的证据证实RNAi技术在现代生物技术中的重要性 ,并可应用于人类基因治疗 .     

Src真核表达载体的构建与表达

构建酪氨酸蛋白激酶Src真核表达载体,并检测其在HEK293T细胞中的表达.根据Genebank（GI：4574718）提供的大鼠Src的cDNA序列设计特异性引物,以大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Src的目的基因,然后克隆至真核表达载体pcDNA3.1.将筛选的阳性重组子转染入HEK293T细胞系,免疫印迹检测Src的蛋白表达水平,经限制性内切酶双酶切及测序分析,扩增的Src的cDNA成功连接入pcDNA3.1,并且序列与Genebank中一致.免疫印迹结果表明,构建的Src-pcDNA3.1可在HEK293T细胞中表达.成功构建了Src-pcDNA3.1真核表达载体,并且可在HEK293T细胞中高效表达.     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A（ChsA）的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

LL-37/hCAP-18基因克隆及其真核表达载体的构建

LL-37 hCAP-18是一种重要的多功能免疫分子.为探讨hCAP-18在基因治疗中的可行性,应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1细胞总RNA中成功扩增出560bp的hCAP-18基因编码区cDNA序列,构建了hCAP-18重组表达质粒phCAP-18.采用脂质体法将质粒phCAP-18瞬时转染COS-7细胞,Westernblot证实,hCAP-18能在COS-7细胞中表达.     

LBM2eHBc＋融合基因植物表达载体构建及对番茄的转化研究

禽流感病毒一直是家禽和家畜健康养殖的巨大威胁,甚至威胁着人类的健康,人们也一直在研究各种形式的疫苗来应对禽流感病毒的威胁.番茄作为生物反应器应用于动物疫苗生产具有独特的优点,本研究优化了番茄子叶的再生体系,同时构建了LBM2eHBc＋融合基因的植物表达载体并对番茄进行了遗传转化.结果表明在玉米素（Zt）浓度为0.5 mg/L时番茄子叶外植体的芽再生率达到93.33%;测序结果证明植物表达载体pBI121-LBM2eHBc＋构建成功;利用农杆菌介导的转化方法获得再生抗性苗34株,经PCR检测,阳性率为75.0%,本研究结果为进一步开发禽流感口服疫苗奠定了基础.     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

导入额外拷贝dctA基因的根瘤菌工程菌株的构建

为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重组表达载体。利用三亲本杂交技术将表达载体转入费氏中华根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。研究表明,转基因工程菌株侵染大豆幼苗后与出发菌相比,固氮酶活性有了显著提高,为提高大豆产量的研究提供一定参考。     

人源抗菌肽LL-37在烟草中的表达

为探讨用植物生物反应器生产LL-37的可行性,利用DNA重组技术将LL-37与植物病程相关蛋白信号肽基因融合,经测序证实序列和阅读框正确后,连接到质粒pBin438上,构建含LL-37 cDNA植物分泌型表达载体pBin/LL-37.通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)介叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum.NC-89).用PCR和Western blot对转化植株进行分子鉴定.80%转基因植株表达重组LL-37多肽.T0代转基因烟草的蛋白粗提物有抑制Staphylococcus aureus和Escherichia coli生长的活性.LL-37基因在转基因烟草中成功表达,提示用植物表达系统生产活性LL-37蛋白是可行的.     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的烟草转化

将所克隆的紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因(TaGST)构建成植物表达载体pBI-TaGST,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38(Nicotiana tabacum cv.W38),获得了转基因的烟草植株.转基因植株的PCR和RT-PCR检测表明,该目的基因已经整合到烟草基因组上.