核糖核苷酸还原酶研究

核糖核苷酸还原酶广泛存在于各种生物中,是生物体内唯一的催化4种核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。该酶是DNA合成和修复的关键酶和限速酶,对细胞的增殖和分化起着调控作用。不同生物中的RR根据其结合的金属辅助因子不同而分类。虽然不同类型RR之间的氨基酸序列相似性很低,但它们有十分相似的三级结构的活性中心和相同的催化功能。RR分子中包含2个变构位点,即酶活性中心和底物特异结合位点。活性中心通过生物有机自由基的作用催化核糖核苷酸还原;底物特异结合位点通过变构作用调控4种dNTPs在细胞内的平衡。因此,该酶不仅是研究DNA合成与修复、细胞增殖与分化及癌症的治疗与抗癌药物开发的重要靶点,同时也是研究酶的结构与功能以及酶的催化机理等的重要工具。本文总结了该酶的种类与分布、结构特征、催化机理及作为抗癌药物开发靶点等方面的研究进展。     

溶液粘度和EcoRI限制性核酸内切酶—P_2-DNA复合物解离的动力学

Eco.RI限制性内切酶像所有球蛋白一样是动力学系统,并且存在着大量的构象底物。酶和底物之间能够发生反应,仅仅在酶蛋白被底物诱导而变构以后,变构能克服起动化学反应的阈值。粘度不仅影响扩散和分子彼此碰撞,而且也影响酶的变构。温度影响溶液粘度,从而也可间接地影响酶的变构。为了证明这种观点,我们在不同粘度和温度条件下,用Eco.RI限制性内切酶切割P_2—DNA,研究了酶——底物复合物催化速度常数的改变。一起考虑来自所有溶液的资料,酶——底物复合物的解离速度常数作为固定粘度下的温度函数和固定温度下的粘度函数被研究。酶——底物复合物的转变速度依赖于溶液粘度,溶液粘度在测定蛋白质动力学状态中起着重要的作用。我们的实验资料表明,最大的催化速度常数Kc值,出现在20%(V/V)的甘油溶液中,在不同温度下,Kc值在高于最适粘度的广大粘度范围内,将随粘度的增加而下降,反之,在低于最适粘度时,Kc值将随粘度的下降而下降。实验结果暗示,EcoRI酶——P_2—DNA复合物解离速度常数值,对于粘度和周围介质产生的酶的调控作用是敏感的。可能的机制将被讨论。     

Alcalase酶解蛋清粉制备抗凝血肽的工艺优化

采用Alcalase碱性蛋白酶酶解蛋清粉制备食源性抗凝血肽。结果表明:底物浓度过大会抑制水解度的增长,底物质量分数为1%时蛋白质完全水解后的产物抗凝血活性最佳;高温和低温均对水解度有影响,低温酶解产物的抗凝血活性较好;pH值对水解度的影响与Alcalase的最适pH值有关;pH值为7时,抗凝血活性最好;酶/底物浓度增大,但底物不变的情况下,对水解度的提高不明显,酶/底物浓度过大,导致抗凝血活性降低。考虑交互作用经试验优化设计确定的酶解最佳工艺参数为:底物质量分数为1%,酶解温度为50 ℃,酶/底物质量分数为5%,酶解pH为8。在该条件下水解2 h,凝血抑制率达到68.92%。     

橡椀单宁降解酶特性的研究

借助于没食子酸丙酯为模型化合物作为底物,对一株能抵抗橡椀单宁(鞣花类单宁)生物毒性并能有效降解这种单宁的菌株的降解特性进行了研究。结果表明这株菌不仅具有单宁酶的活性,而且具有多酚氧化酶（PPO）的活性。通过对不同底物对内胞霉PPO酶促反应速度的影响研究证实橡椀单宁的降解不仅与单宁酶有关还与多酚氧化酶有关。     

磁场影响固定化葡萄糖异构酶活性的研究

采用丹麦Novo公司测固定化葡萄糖异构酶 (SweetzymeT)活力的反应体系 ,用半胱氨酸 -咔唑法评价酶的活性 ,研究了磁场在不同条件下对酶活力的影响。实验发现 :在不同磁化时间、温度、磁场强度和pH条件下磁化底物 ,使其活性增加可达 2 8 6 % ,并且具有可逆性 ,但磁化固定化酶或磁场作用于酶—底物反应体系 ,未见酶活力的明显变化。     

中国传统发酵食品中溶栓酶活性检测方法比较

通过正交实验设计建立最佳琼脂糖-纤维蛋白平板法,并比较改进的纤维蛋白平板法和四肽底物法测定中国传统发酵食品中溶栓酶的活力的线性和精密度,以找出一个灵敏易操作、经济实惠、快速准确地标示溶栓酶效价的活性检测方法。实验结果显示纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在50～800IU.mL-1、0.03～2.60U.mL-1范围内具有良好的线性关系,且日间和日内变异系数均小于6%。因此,纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于溶栓酶的活性检测,前者测定结果比较直观,但四肽底物法操作比较简单,经济成本相对较低,灵敏度高,更适合溶栓菌株的高通量筛选。     

组氨酸残基在焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶催化功能中的作用

应用焦碳酸二乙酯(DEPC)对焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(PFP)进行化学修饰时,酶的活性迅速丧失,呈拟一级动力学反应.羟胺的复活作用及修饰后酶的紫外光谱变化表明,酶失活的原因是DEPC与酶的组氨酸残基形成了乙酯基组氨酸复合物.失活动力学表明,酶的活性位点结合1分子DEPC即丧失活性.活性位点的组氨酸残基的完整性是酶活性的必要条件之一.底物F6P、产物果糖1,6-二磷酸(FBP)、P i及激活剂果糖2,6-二磷酸(F2,6BP)均可保护酶免被DEPC失活,底物PP i却没有保护作用.组氨酸残基在酶的催化功能中可能与F6P,FBP及P i的结合过程有关,而与PP i无关.     

水蛭的酶解及其产物抗凝血活性评价

以水蛭为原料,研究不同酶解因素(酶种类、酶用量、酶解时间、pH值、酶解温度、底物浓度)对水蛭酶解产物抗凝血活性的影响规律,优化水蛭的酶解技术参数,并对酶解产物进行活性评价;研究结果表明,优化后的酶解技术条件为,适宜的水解酶为胰蛋白酶,酶用量7000 U/g,酶解时间7 h,酶解pH 8.3,酶解温度50℃,底物浓度14%(w/w)。在该条件下得到的酶解产物抗凝血酶活性最高,达到640 U/g。     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

绿豆芽淀粉酶的活性及应用

目的测定绿豆芽生长不同时期酶的活性.方法采用正交试验设计方法,对影响绿豆芽淀粉酶活性测试的"最适条件"进行研究.结果绿豆芽在生发84 h左右,温度60℃,pH 5.0,底物体积质量20 g/L,酶体积质量0.5 g/L,底物与酶作用时间60 min时,淀粉酶活性最高.结论通过对绿豆芽生长的不同时期酶活性的研究,为进一步实现绿豆芽淀粉酶应用提供理论依据.     

底物扩散对分子筛固定化葡萄糖淀粉酶性能的影响

对分子筛固定化葡萄糖淀粉酶在固定床反应器中淀粉液化液的扩散和对固定化酶酶促反应的影响进行了研究;并与反应动力学模型相关联,较系统地探窿了底物溶液流速、底物溶液浓度、载体粒度、载体再造孔等因素对固定化葡萄糖淀粉酶活力的影响;提高了通过再造孔成型能够有效减小外扩散和内扩散的影响,显著提高固定酶的活性。     

奥扎格雷对酪氨酸酶的抑制机理

奥扎格雷不仅能抑制酪氨酸酶单酚酶的活性,而且能够抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。对单酚酶的抑制作用主要表现为抑制酶活,并且使得酶催化反应的延滞时间有明显的延长,而对二酚酶的抑制作用,主要表现为抑制二酚酶酶活。同时,讨论了酚氧化酶的催化氧化的机理:酶和底物结合后,会形成一个新的疏水性的"口袋",抑制剂奥扎格雷会嵌入这个"口袋",形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。     

胰酶水解干酪素的动力学行为

研究了胰酶水解干酪素制备蛋白胨过程中胰酶在不同温度下的失活行为,以及底物浓度对反应速率和平衡的影响,ｐＨ对反应浓度和平衡的影响。胰酶在４０℃下４ｈ基本不丧失水解大分子的活力;在５０℃,ｍｉｎ、５５℃,１００ｍｉｎ、６０℃,９０ｍｉｎ完全丧失对大分子的水解活性。胰酶短时间在高温下丧失的活性,当其返回到４０℃时可部分恢复。底物和产物对反应有抑制作用。底物初始浓度高,最终平衡转化率低。当ｐＨ８时的反应速     

甘蔗叶灼病解毒蛋白——AlbD S40位点饱和突变分析

利用overlapping PCR技术对甘蔗叶灼病解毒蛋白-AlbD酶S40关键位点进行饱和突变,共获得19种突变子,并测试不同突变子的脱毒活性和酯酶活性.结果显示,S40A和S40R突变子分别使AlbD酶脱毒活性提高12.8%和9.5%.以对硝基苯丁酸酯为底物,S40Q可使AlbD酶酯酶活性提高20%;以对硝基苯戊酸酯为底物,S40G可使其活性提高30%.     

尿激酶原活性测定方法研究

以双链尿激酶国际标准品（IS）为对照，用显色底物法和凝块溶解法测定糖基化和非糖基化的尿激酶原的酶活性，结果表明与凝块法相比，显色底物法测定两种形式的尿激酶原的酶活力相近，测量误差小，重复性好，更适于产品的质量控制。     

Trichoderma reesei纤维素水解酶的糖苷合成性质

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(从(Trichoderma reesei天然纤维素水解酶中分离纯化得到了一种相对分子质量约为65 000的蛋白组分.分别以pNP-Glu、pNP-Gal、oNP-Gal和Avicel作为底物,均检出该组分的水解活性.此外该酶对CMC-Na有可被测出的弱活性.以pNP-Glu为底物,45℃时,其水解酶性质的米氏常数Km=3.04 mg/mL,Vmax=3.77 μmol/min.用DNS法和对硝基苯酚法(仅对含有对硝基酚结构的底物pNP-Glu、pNP-Gal和oNP-Gal)分别检测了在180 min反应时段内产物还原糖和对硝基苯酚的含量变化,结果显示在封闭的反应体系中有明显的可逆反应存在,并出现了周期性振荡的特征,有糖苷合成活性的表现,水解产生还原糖和对硝基苯酚的量,呈现出分别为25.43±8.34 min和36.25±2.50 min的含量增减振荡周期.与此同时,为了证实该酶糖苷合成活性的存在,以葡萄糖作为底物与酶反应,得到了7.00±4.83 min的葡萄糖含量周期性波状振荡结果.对底物为pNP-Glu反应15 min后的产物作乙酰化处理GC/MS分析,结果产物中有含二糖结构的产类型,揭示了这个水解酶的糖苷合成的特点.这是首次从Trichoderma reesei纤维素水解酶中分离得到了具有糖苷合成活性的酶.     

菊芋多酚氧化酶的酶学性质

为了解菊芋提取物氧化变色的机理,用分光光度法分别研究了以邻苯二酚为底物的酶促褐变反应动力学和pH值、温度、底物浓度、酶浓度对该反应的影响,以及不同底物对多酚氧化酶活性的影响,揭示了菊芋多酚氧化酶(PPO)的基本酶学性质.结果表明:菊芋PPO催化邻苯二酚氧化反应的最适pH值为4.8,最适温度为35℃;菊芋PPO的热稳定性差,85℃以上加热处理5min就可使其大部分失活;菊芋PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程所描述的规律,相应的动力学参数Km=0.013 mol/L,Vmax=7.5 mmol/s.菊芋PPO的活性随酶浓度的增加而增大,酶的添加量超过0.8mL后,增速逐步减小;菊芋多酚氧化酶对邻位多酚的氧化具有专一性.     

嗜热酯酶EstTs1的远源三维结构模建及分子对接

利用Phyre网络服务器,构建嗜热酯酶EstTs1的三维结构,并通过分子动力学优化构型,得到了可靠的构型.分子对接研究表明,p-硝基苯基丁酸酯是EstTs1的最适底物,其大小正适合EstTs1的活性口袋.Thr111是底物与酶结合的重要残基,与底物形成了氢键; Ser85是重要的催化残基.     

吲哚乙酸氧化酶和过氧化物酶同工酶的分离及其对底物的特性

用CM-纤维素柱从花椰菜的游离型过氧化物酶提取液中分离得到6个酶峰,分别出现于不同洗脱浓度的NaCl洗脱液中,它们都具有过氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶活性。从结合型过氧化物酶提取液中分离得到5个酶峰,其中被115mmol.l~(-1)NaCl洗脱的为一高活性吲哚乙酸氧化酶峰,它的过氧化物酶活性很低。其余的酶峰都具有两种酶的活性。用不同的底物测定同工酶的活性,得到很不相同的结果。不同的同工酶的最适pH因底物不同而异,愈创木酚为pH5.0～6.0,咖啡酸为pH4.5～5.0,阿魏酸为pH8.5～9.0,但各同工酶之间没有明显差异。     

温度、压力、底物浓度和光照强度对过氧化氢酶动力学性质的影响

本试验以极谱氧电极法测定苹果叶片中过氧化氢酶促反应曲线的斜率表示酶的活性,研究了温度、压力、底物浓度和光照强度等物理因子对过氧化氢酶活性的影响。结果表明,酶活性在10～50℃范围内随温度升高酶活性增强,底物浓度对酶的影响符合米氏方程;压力对酶活性的影响,随负压的加大,酶活性有提高的趋势;光强对酶活性的影响,表现为二次曲线型。