信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

GH43家族β-D-木糖苷酶RuXyn1在马克斯克鲁维酵母中的表达及其应用

木聚糖的降解需要内切β-木聚糖酶和β-D-木糖苷酶的协同作用,β-D-木糖苷酶能将β-木聚糖酶的水解产物木寡糖降解为木糖,因此在半纤维素的利用中具有重要的意义.本研究将中国牦牛瘤胃微生物来源的糖基水解酶GH43家族β-D-木糖苷酶基因RuXyn1克隆到含两种不同分泌信号肽(菊粉酶信号肽和α-factor信号肽)的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)分泌表达载体(pUKDN132和pUKDN129)中,转化K.marxianus Fim-1 ura3Δ,通过筛选获得两株分泌表达β-D-木糖苷酶基因RuXyn1的重组菌株Fim-1/pUKDN132-RuXyn1和Fim-1/pUKDN129-RuXyn1.重组菌株摇瓶培养72h后,上清液中β-D-木糖苷酶酶活分别为0.304U/mL和0.045U/mL.在5L发酵罐高密度发酵中,Fim-1/pUKDN132-RuXyn1分泌表达的β-D-木糖苷酶酶活为1.75U/mL,而Fim-1/pUKDN129-RuXyn1的酶活为1.6U/mL,表明在表达β-D-木糖苷酶RuXyn1时,菊粉酶信号肽介导的分泌效率优于α...     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

木霉No.183菌株木聚糖酶的研究

 筛选到一株木聚糖酶高产木霉菌株(No.183),研究了该菌株产木聚糖酶的液态发酵和粗酶液的酶学性质.结果表明,以麸皮和木聚糖为主要碳源,28℃,190r/min摇瓶培养时,木霉No.183菌株在接种后84h酶活最高,达到298.47U/mL.该木聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适pH为该木聚糖酶在pH5～7和40℃以下时相对稳定.Ca²⁺,Zn²⁺和Cu²⁺对该木聚糖酶有较强的促进作用,Fe³⁺和Hg²⁺对该酶有较强的抑制作用.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

产木聚糖酶菌种的筛选及其在纸浆漂白中的应用

筛选出高产木聚糖酶的菌株,并将其应用于纸浆漂白。采用乙醇水解圈法筛出一株产木聚糖酶较高的菌种,并对其酶学性质进行了研究,同时对菌种做了初步鉴定,进一步探讨了其酶液在纸浆漂白中的应用。研究结果表明筛选得到的菌种酶活最高可达642 U/mL,经初步鉴定为米曲霉;菌体最适产酶温度为50℃,酶活最适温度为50℃,pH为5～6;当木聚糖酶用量为6U/mL时,效果达到最佳,卡伯值由32.3降低至25.5,白度由37.2提高到48.7,提高约31%。     

木聚糖酶产生菌的筛选与部分酶学特性的研究

通过富集培养、水解圈鉴定、酶活检测等步骤,从不同地点采集含木聚糖的土样中初筛出10株木聚糖酶产生菌,获得一株酶活最高的菌株Bacillus sp. X-18.对Bacillus sp. X-18木聚糖酶的部分酶学特性进行了研究,结果显示:菌株X-18酶活最适温度为50 ℃,在50 ℃保温1 h仍保持100%的酶活力.该酶pH值范围较广,在pH4.0-8.0范围内均能保持较高的活性,最适为pH5.0,与其相关报道的研究相比,该木聚糖酶具有良好的酸碱耐受性.     

银杏疫病的研究

对银杏苗圃中发生苗枯的植株进行病原分离及回接试验,发现引起银杏苗枯的病原为Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓｐ．称这种苗枯为银杏疫病。该病危害银杏幼嫩苗木的地上部分,未见危害根部和多年生成林树。叶片受害似开水烫伤状,茎干受害则变黑,黑色病斑环绕茎干一周后,病茎以上部分叶片青枯萎垂。病原菌在ＰＳＡ培养基上,菌落白色绒毛状,２８℃下７ｄ可长出大量孢子囊,易产生厚壁孢子,病菌生长适宜温度为２４℃～３２℃。人工接种可致受伤银杏叶片及幼嫩茎干严重发病,但无伤茎叶发病较轻或不受害。在田间,该病５月初开始发生,３ｄ～５ｄ病情达到高峰,苗圃的发病率为１０％～２０％,有明显的发病中心,５月底病情稳定,以后病害不再发生。用含药培养基及含药纸碟法测定,甲霜灵及甲霜灵锰锌对病原菌有很强的抑制作用。病原种鉴定正在进行。     

黄连水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的抑菌作用

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是一种生长快速且肉质鲜美的经济型海水养殖鱼类,但是近些年为满足人们的日常需求,在不断扩大养殖的同时病菌也逐渐泛滥。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是华南沿海地区海水养殖鱼类细菌性鱼病的主要致病菌之一,给水产养殖业带来巨大损失。本研究对黄连(Coptis chinensis Franch)的抗菌作用进行系统研究,目的是为由溶藻弧菌引起的爆发性细菌性鱼病的高效防治提供科学的用药依据。本研究采用二倍稀释法测定黄连水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)和半数致死量(LD50),并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细菌超声破碎上清液中可溶性蛋白含量。结果表明,黄连水提物对溶藻弧菌具有明显的抑制作用,其对溶藻弧菌的MIC、MBC和LD50的值分别为7.800mg/mL、31.250mg/mL和15.625mg/mL。胞内可溶性蛋白含量变化的结果提示:黄连发挥抑菌作用的机制可能是通过损伤细菌的细胞壁导致细菌内容物的释放并引起菌体裂解死亡。黄连具有发展成为一种高效抗水产病害中草药制剂的潜力。     

威灵仙水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的抑制作用

近年来水产养殖行业不断扩大,但随之而来的鱼病对养殖行业造成了巨大损失.本研究以卵形鲳鲹(前期发病)上分离出的溶藻弧菌为实验对象,批量筛选多种中草药,选择抑菌效果最好的一种或几种中草药,并探究不同浓度中草药水提物的抑菌效果,确定其杀菌浓度(MBC)及最小抑菌浓度(MIC),再通过生化指标胞内乳酸脱氢酶(Lactate d...     

家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜结构的观察比较

为探讨家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜组织结构与其生活环境适应的关系,用光镜观察了3种动物视网膜的组织结构,测量了3种动物视网膜各层厚度、3个核层的胞核层数及胞核直径。用免疫组化观察了Nogo C蛋白在3中动物视网膜的表达情况。结果表明:家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜均由4层细胞构成,在显微镜下分为10层。家鸽、毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜平均厚度分别为416.29、437.90、419.36μm。毛腿沙鸡视网膜内核层和节细胞层的层数比家鸽和灰斑鸠的多,视细胞数亦较家鸽和灰斑鸠的多。毛腿沙鸡和灰斑鸠视网膜内核层、内网层、节细胞层和神经纤维层4层厚度所占总厚度比例(分别为69.77%、68.05%)要比家鸽(49.97%)的高。表明毛腿沙鸡具有比家鸽和灰斑鸠更强的视觉分辨能力和对强光的适应能力,毛腿沙鸡和灰斑鸠的视神经要比家鸽的发达。Nogo C蛋白在正常状态下视网膜中的表达可能发挥某些特定的生理作用,但还需进一步研究。     

车八岭自然保护区海南开鸟栖息地特征的初步研究

2001年4月在车八岭国家级自然保护区内，通过实地观察并结合保护区有关工作人员近几年的观察，确这海南Jian（Gorsachius magnificus）栖息活动和觅食活动比较频繁的6个主要地点（包括当地村民曾经捕获该鸟的砌切地点），用全球卫星定位系统（GPS）确定各地点的方位，并对各地点的海拔高度，坡度，坡向和植被等进行考察。结果表明，车八岭保护区内海南Jian主要选择水源丰富，鱼虾充足的小溪流作为觅食地点，栖息地主要分布在海拔600m以下，栖息地类型主要有常绿落叶混交林，针阔混交林，灌草丛及竹林等。     

南方根结线虫侵染对乌桕癞皮夜蛾幼虫生长发育和食物利用的影响

为明确南方根结线虫(Meloidogyne incognita)侵染对癞皮夜蛾(Gadirtha fusca)幼虫的影响是否因龄期而异,本研究以南方根结线虫侵染乌桕(Triadica sebifera),选用该植株叶片饲喂癞皮夜蛾大龄幼虫,以未受南方根结线虫侵染植株的叶片作为对照,比较不同龄期幼虫生长指标和食物利用指标的差异。结果表明：随着幼虫龄期的增加,癞皮夜蛾幼虫体质量、取食量及发育历期呈上升趋势;相对生长率呈下降趋势;食物利用率和食物转化率先上升后下降,而近似消化率则呈先下降后略微上升的趋势。线虫侵染处理后,与对照相比,癞皮夜蛾4龄幼虫的相对生长率、食物利用率和食物转化率显著提高;5龄、6龄幼虫的虫体质量和5龄幼虫的相对生长率以及6龄幼虫的取食量、近似消化率、化蛹率显著降低。南方根结线虫侵染对癞皮夜蛾幼虫生长及食物利用的影响因发育阶段而异,主要通过抑制两个末龄龄期幼虫的生长发育及化蛹,从而间接减轻癞皮夜蛾对乌桕的危害。     

假高粱、黑高梁和高粱细胞学指标比较及其生态学意义

假高粱(Sorghum halepense(L.)Pers.)是世界十大恶性杂草之一.黑高粱(S.almum Parodi)和高粱(S.bicolor(L.)Moench)是假高粱的两种近缘种,其中黑高粱有入侵性,高粱则为栽培植物,不表现出入侵性.为了解影响植物入侵能力的生物学因素,比较了高粱属3种植物根尖分生组织细胞的染色体、细胞核、细胞大小和细胞有丝分裂指数.结果表明,高粱染色体平均投影面积最大,其次是黑高粱,假高粱的最小;就细胞和细胞核大小而言,都是高粱最大、其次是黑高粱和假高粱;在25~35℃的温度范围内,高粱根尖分生区细胞的有丝分裂速率最低,假高粱的最高.3种植物的种子(颖果)以高粱最大,黑高粱和假高粱的显著小,幼苗相对生长速率以高粱最小,假高粱的最高.3种植物的细胞分裂速率与其染色体、细胞核、细胞和种子大小存在显著相关,表明入侵性植物往往具有较小的分生组织细胞、细胞核和种子,但是有相对高的细胞分裂速率和幼苗相对干重.因此,根尖分生组织细胞学指标在高粱属植物入侵能力评估上有潜在应用价值.     

拟南芥雄性不育突变体opw(only pollen wall)候选突变基因的克隆

在T-DNA插入突变体Salk_059463株系的群体中,筛选到两株雄性不育突变体,对TDNA序列上的一对引物进行PCR鉴定,结果表明:其基因组中没有T-DNA插入.遗传分析表明这两株雄性不育突变体由同一单个隐性基因控制,引起不育的主要原因是从花药发育的第8期开始,小孢子细胞质内容物逐渐减少直至消失,到花药发育的第12期,药室内的小孢子只剩下一个花粉壁空壳,故该突变体命名为opw(only pollen wall).利用图位克隆的方法对OPW基因进行了定位,结果表明OPW基因位于第二条染色体上分子标记T28M21和T3G21之间的12 kb区间内,该区间内一共有21个基因注释.通过克隆区间内的基因并测序发现opw-1突变体基因组中At2g40140基因编码序列的外显子在第289和第290个碱基之间插入了一个A碱基,而opw-2突变体基因组中At2g40140基因编码序列的外显子在第412和第413个碱基之间插入了一个T碱基,造成的编码序列移码使第424至第426碱基成为终止密码子,故At2g40140是编码OPW的候选基因.