睾丸特异表达蛋白质RNF138的表达纯化及抗体制备

目的:制备RNF138的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mRNF138的开放阅读框,并克隆至原核表达载体pET-30a中;将测序正确的pET-30a(+)/mRNF138重组质粒转化大肠杆菌Rosseta菌株,经IPTG诱导表达后通过镍离子螯合柱(Ni-NTA)...     

细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究

本文对细辛(Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum(Maxim)kitag)中多糖进行了分离纯化以及初步的免疫活性研究。沸水提取细辛粗多糖,经80%醇析、Sevag法脱蛋白、DEAE-纤维素离子交换层析对粗多糖进行纯化得多糖级分A-1.5-水、A-1.5-0.1M、A-1.5-0.3M、A-1.5-0.5M、A-4-水、A-4-0.3M,并对级分A-1.5-0.3M做了进一步的研究。经Sepharose CL-6B分子筛层析测定其分子量约为4万。高效液相色谱(HPLC)法测定其单糖组成为半乳糖醛酸(74.7%)、阿拉伯糖(9.7%)、木糖(7.1%),此外还有痕量的半乳糖、葡萄糖醛酸存在。说明A-1.5-0.3M是一种以酸性糖为主的杂多糖。淋巴细胞转化试验结果表明细辛多糖A-1.5-0.3M对小鼠脾T、B淋巴细胞的体外增殖有明显的促进作用。     

细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究

本文对细辛(Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum(Maxim) kitag)中多糖进行了分离纯化以及初步的免疫活性研究.沸水提取细辛粗多糖,经80%醇析、Sevag法脱蛋白、DEAE-纤维素离子交换层析对粗多糖进行纯化得多糖级分A-1.5-水、A-1.5-0.1M、A-1.5-0.3M、A-1.5-0.5M、A-4-水、A-4-0.3M,并对级分A-1.5-0.3M做了进一步的研究.经Sepharose CL-6B分子筛层析测定其分子量约为4万.高效液相色谱(HPLC)法测定其单糖组成为半乳糖醛酸(74.7%)、阿拉伯糖(9.7%)、木糖(7.1%),此外还有痕量的半乳糖、葡萄糖醛酸存在.说明A-1.5-0.3M是一种以酸性糖为主的杂多糖.淋巴细胞转化试验结果表明细辛多糖A-1.5-0.3M对小鼠脾T、B淋巴细胞的体外增殖有明显的促进作用.     

4种酶质量浓度对小鼠睾丸间质细胞分离效果的比较

目的:比较4种酶质量浓度对原代小鼠睾丸间质细胞的分离效果.方法:将20只成年雄性昆明小鼠睾丸平均分成A、B、C、D 4组,分别用0.05%、0.125%、0.25%胰酶和0.02%胶原酶Ⅱ消化分离睾丸间质细胞,比较4种酶质量浓度分离的间质细胞数量和存活率;分别用苏木素-伊红染色、苏丹Ⅲ染色观察间质细胞及其脂滴形态.结果:A组和B组分离的间质细胞数多于C组和D组(P0.05).4种酶质量浓度所分离的间质细胞存活率均在90%以上,差异无统计学意义(P0.05).低浓度胰酶(0.05%和0.125%)所分离的间质细胞生长状态良好,细胞内脂滴小而丰富,长时间体外培养后胞质空泡化,脂滴发生融合.结论:低质量浓度胰酶对原代间质细胞分离效果好.     

濒危植物桫椤过氧化物酶的分离纯化与性质

将齿叶黑桫椤叶片提取液经硫酸铵盐析、透析、DEAE-琼脂糖凝胶柱层析和Sephacryl S-200凝胶柱层析分离得到纯化的POD,其纯化倍数为26.29,回收率为27.04%;通过SDS-PAGE法测得POD的分子量为43000D;通过IEF-PAGE法测得POD的等电点为4.55;齿叶黑桫椤POD最适pH在4左右;最适温度在45℃左右;Km值在最适温度45℃、最适pH4的条件下为0.07 mol/L。     

麻疯树过氧化氢酶的分离纯化

麻疯树种仁经抽提、硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B层析、DEAE-Sepharose F.F.层析,获得了纯化的麻疯树过氧化氢酶(CAT).该酶比活力为69.23 U/mg,纯化倍数为37.63倍.经Sephacryl S-300 HR测定,该酶表观分子量为232 kD,SDS-PAGE显示为一条分子量为59 kD的条带,表明该酶是由四个相同的分子量为59 kD的亚基组成.经等电聚焦测定该酶的等电点为4.7.经过温度和pH考察,该酶最适温度为30℃,最适pH为7.0.Mn~(2+)对酶活有促进作用,Zn~(2+)、Cd~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Co~(2+)有抑制作用.6×10~(-3)mmol/L NaN_3以及0.9 mmol/L KCN能使酶活丧失.该酶的V_(max)和K_m分别为5 U/mL·min,1.5 mmol/L.     

壳聚糖酶的分离纯化及其特性研究

通过硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25凝胶过滤层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析,将曲霉TCCC45017产的壳聚糖酶进行纯化,纯化倍数为57.21,回收率为26.55%,比活力提高至587.55 U/mg.经过SDS-PAGE电泳测得其分子质量为3.75×104 u.该酶作用的最适温度为55℃,最适pH为5.5,50℃以下保温1 h内酶的热稳定性较好,pH稳定范围为5.5～7.0,添加金属离子Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+对该酶有激活作用,Cu2+、Fe2+、Zn2+、Al3+则对酶有抑制作用.     

云芝漆酶同工酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sephrose Fast Flow和Sephadex G-100两步柱层析,得到2种漆酶同工酶,分别命名为LccA和LccB.以ABTS为底物在适当条件下与酶带反应呈绿色谱带鉴定出漆酶谱带.LccA的纯化倍数和回收率分别为53.88和7%,LccB的纯化倍数和回收率分别为208.21和29%.用SDS-PAGE测定两漆酶的分子量分别为64.2 ku和60.7 ku;LccA和LccB的最适作用温度分别是40℃和50℃;最适反应pH值为3.5和4.0;其N-末端部分氨基酸序列为AIGPK和GIGPV,与其他真菌漆酶相比显示很高的同源性,以ABTS为底物的Km值分别为68.96μmol/L和76.92μmol/L.Cu2 对两同工酶都有明显的激活作用,Fe2 ,Ag 完全抑制两同工酶的活性.     

蕲蛇蛇毒中凝血酶样酶的分离纯化与特性

蕲蛇粗毒经DEAE -SephadexA - 5 0、POROS 5 0HS及TSKG30 0 0SW分离纯化 ,得到 1个具有凝血酶活力的峰 .该峰经SDS -PAGE和PAGE检测均为一条带 ,分子量约 2 8.0kDa ,加DTT处理后 ,拆分为约 14.8kDa的亚基 .其凝血酶活力为 14.7NIHu/mg ,精氨酸酯酶活力为 2 1.98TAMEμmol/mg·min .该组分具有激活因子ⅩⅢ的活性 ,但没有明显的出血反应 .肝素不影响该组分的凝血酶和精氨酸酯酶活性 ,EDTA、PMSF、DFP则会产生不可逆抑制作用 ,表明该组分属于金属蛋白 .     

固定化酶催化合成头孢克洛与产物的分离纯化

应用来源于粪产碱杆菌的青霉素G酰化酶催化合成头孢克洛,并对生物转化反应过程进行了研究.在反应条件:pH 7.0、25℃、磷酸钠缓冲体系、加酶量3 U/mL和底物浓度60 mmol/L时,转化率达到85%,表明粪产碱杆菌青霉素G酰化酶具有较高的催化活力.研究了新型分离纯化方法,经过树脂分离的产物纯度超过95%,主要杂质含量小于0.5%,可以达到药典要求,为生物法合成头孢抗生素走向产业化奠定了基础.     

鲤鱼肌肉中胶原蛋白酶的分离纯化与性质分析

利用明胶酶谱法,在鲤鱼肌肉中检测到了一种具有分解胶原蛋白能力的丝氨酸蛋白酶.通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel和Phenyl-Sepharose等一系列柱层析法,纯化得到了分子质量为70 ku,能够降解胶原蛋白的丝氨酸蛋白酶(Collagenolytic Serine Proteinase,CSP).性质分析表明,CSP在弱碱性条件下显示活性,最适温度为30℃;丝氨酸蛋白酶抑制剂特异抑制CSP的活性.CSP能有效地分解鲤鱼肌肉中的I型胶原蛋白,提示其可能在鱼体死后肌肉胶原蛋白降解中发挥着重要的作用.     

动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化

本文主要以动物脑组织为材料,经热变性、离心、葡聚糖SephadexG-50分离纯化,通过紫外吸收图谱、二步酶解法检验钙调蛋白的纯度、浓度。结果显示,利用本法可分离纯化得到的钙调蛋白对PDE的激活倍数为83.3,比标准的钙调蛋白(对PDE的激活倍数为67.4)更具生物活性.     

泡桐叶绿体DNA的分离纯化与电镜观察

用差速离心和DNA酶处理的方法从泡桐叶片制得纯净、完整的叶绿体,经苯酚一氯仿抽提、RNaseA处理分离提取叶绿体DNA(ctDNA)。进行琼脂糖凝胶电泳得到单一的谱带,电镜观察泡桐叶绿体为不规则椭球体,直径约15～3μm,ctDNA为双螺旋环状分子,长度约42μm,估计其分子量约86～90×10~6。     

番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,对其酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性.分离纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析、Con A Sepharose 4B亲和层析.经纯...     

硫酸软骨素酶的分离纯化及部分性质

通过细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S-200柱层析,首次从粘质沙雷氏菌中提取出硫酸软骨素酶.纯化倍数11.46,比活为81.23 U/mg蛋白.提取液经PAGE和SDS-PAGE检测,呈现一条带.该酶相对分子质量为71.2 KD,亚基分子质量为35 KD,该酶为2个相同亚基组成.等电点为7.19,最适pH值7.5,最适温度为40 ℃,以4-硫酸软骨素为底物测得Km值为3.98×10^-4 mol/L.     

番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,对其酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性.分离纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析、Con A Sepharose 4B亲和层析.经纯化的番薯过氧化物酶比活力为6 930 U/mg,SDS-PAGE显示一条带,分子量为34 000,RZ值为2.酶反应的最适pH在5.5附近,最适温度为70℃;在中性偏碱性条件下酶的稳定性非常高,60℃保温1 h,酶活力残余60%.结果表明番薯过氧化物酶是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化工艺研究

以人工饲养的北星二号蚯蚓为材料,通过对14种进口和国产离子交换树脂和 DEAE-纤维素的筛选试验和比较研究,确定了蚯蚓纤溶酶的分离纯化的较佳工艺:组织匀浆或磷酸缓冲液保温提取→Amberlite IRA 904或 DEAE-纤维素离子交换柱层析分离→Sephadex G 100或 Sephadtx G 75凝胶层析纯化→真空冷冻干燥得蚯蚓纤溶酶冻干粉。该工艺所需设备简单,操作方便,适合中,小工厂生产     

灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究

将灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶经过Sephadex G-75和DEAE-Sepharose Fast Flow两步纯化,获得具有3个同工酶的组分,并且纯度提高了81倍,酶活回收率高达83.9%。以ABTS为底物,漆酶最适pH值是2.2～2.6,在pH值4.6～7.8范围内稳定;最适温度45℃,在低于45℃时较稳定。大部分金属离子、酸根离子对灵芝漆酶普遍有抑制作用,除盐可以提高漆酶活力。     

棕色固氮菌氢酶的分离纯化及其性质

Stephenson和Stickland首先发现了可逆性催化分子氢活化的氢酶。此后人们发现氢酶广泛地存在于各种类型的细菌中。Dixon指出氢酶可能有三种功能:(1):通过氧化氢消除氧;(2)解除氢对固氮酶的抑制作用;(3)补充在循环中由于释放氢而消耗的能量。他还指出氢的氧化作用与磷酸盐的酯化相偶联。鉴于氢酶在固氮过程中的重要意义,弄清氢酶与固氮酶的相互关系对于阐明生物固氮机制将是重要的。然而以往对于氢酶的分离纯化多限于嫌气性固氮微生物,而对好气性固氮微生物的氢酶所做工作不多。为此,我们结合以往的工作,对棕色固氮菌的氢酶进行了分离提纯和性质的探讨,以期逐步解决氢酶和固氮作用的关系。