PCR新技术

ＰＣＲ是多聚酶链式反应，是一种无细胞分子克隆法，是近年发展起来的一种快速的特定ＤＮＡ片段体外扩增法。本文将讨论ＰＣＲ试剂，设备以及ＰＣＲ最佳条件。     

猪瘟病毒RT—PCR产物的T载体克隆,测序及同源比较

利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的无模板延伸活性制备了可直接克隆ＰＣＲ产物Ｔ载体，苗对猪瘟病毒ＨＣＬＶ株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行了克隆。     

半套式PCR技术在植物基因克隆中的应用

常规ＰＣＲ方法在分离克隆已知序列的基因中发挥着重要的作用，但要求目的基因片段与引物间的同源性几乎是１００％，一旦引物序列与目的基因间存在有差异，便往往会导致扩增的特异性不强，扩增效率不高，给克隆带来很大的困难．在常规ＰＣＲ基础上，若所分离的基因在不同植物间存在保守序列，依据这一序列再合成一对引物，进行半套式ＰＣＲ则能大大提高扩增的特异性及扩增效率．对于较长的基因片段而言还能同时完成亚克隆．本文依据南瓜ＧＰＡＴ（甘油－３－磷酸酰基转移酶）基因ｃＤＮＡ序列及比较拟南芥菜、豌豆间在该基因内的保守区段序列合成相应引物来分离克隆黑子南瓜及西瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段为例来说明半套式ＰＣＲ技术在植物基因克隆中的应用     

利用聚合酶链反应鉴定重组TPO阳性克隆

报道了利用取合酶链式反应（ＰＣＲ）鉴定重组ＴＰＯ阳性克隆的方法，同时比较了该方法与酶切鉴定的结果。取转化克隆小量提取质粒琼脂糖电泳分析，对怀疑含有重组子的工程菌进行ＰＣＲ鉴定，结果阳性克隆得到了特异性扩增片段。该方法与酶切鉴定结果完全一致，其优点是简便、灵敏、特异。     

限制酶SmaⅠ参与的PCR产物克隆技术

介绍了一种增加连接效率的ＰＣＲ产物克隆技术，即ＳｍａⅠ内切酶参与的ＰＣＲ产物与ＳｍａⅠ酶切的载体的连接；并通过克隆黄鲜基因组中一段约２５０ｂｐ的ＰＣＲ产物的实例证实了该技术的可靠有效性。     

非综合征母系遗传耳聋的分子遗传学研究

对一个母系遗传的“线粒体耳聋”家系,应用ＰＣＲ,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ,ＰＣＲ－ＲＦＬＰ,ＰＣＲ产物克隆测序技术对该家系ｍｔＤＮＡ进行了分析,发现该家系全部患者都有ｍｔＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因１５５５位点Ａ１５５５Ｇ突变,另外,除此突变位点外,我们还在部分患者中发现了一新的突变位点：ｍｔＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因１４３８位点Ａ→Ｇ改变,说明Ａ１５５５Ｇ突变可能是导致该家系耳聋的主要因素之一．     

加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆

以加工番茄８７－５为材料,运用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地将ＰＧ基因的ｃＤＮＡ序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,并利用酶切及ＰＣＲ进行了初步鉴定。     

细茎大豆（G.gracilis）rbcS基因结构与分子进化分析

从细茎大豆的嫩叶中提取总ＤＮＡ，用ＰＣＲ方法扩增得到包含完整编码区的ｒｂｃＳ基因并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。完成全基因１０８９个核苷酸测序后，运用ＰＣＧＥＮＥ进行顺序编辑和同源比较，并应用ＭＥＧＡ１．０２１软件中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ方面画出Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基仓的系统进化树。     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。     

人抑癌基因nm23—H1在逆转录病毒载体上表达的研究

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。     

克隆胃粘膜细胞癌变相关基因的思路

采用ｍＲＮＡ和ＡＰ－ＰＣＲ等技术克隆胃粘膜细胞癌变相关基因在技术上是可行的。胃粘膜细胞癌变相关基因的获得，在阐明胃癌发生机制及胃癌的早期诊断和临床治疗方面，具有重要意义和广阔的应用前景。     

—3位碱基对HBVc基因在昆虫细胞中表达的影响

应用ＰＣＲ定点突变技术,分别扩增出－３位碱基是Ａ或Ｔ的乙肝病毒核心抗原基因ｃ１,ｃ２,平端克隆到自行构建便于ＰＣＲ产物克隆的通用载体ｐＢｌｕｅｏＳ中后,利用经ＰＣＲ引物在ｃ１及ｃ２末端引入的酶切位点,切出ｃ１,ｃ２基因,构建出ｐＸ３－ｃ１和ｐＸ３－ｃ２．在Ｓｆ９细胞中瞬时表达ｃ１,ｃ２基因,乙肝核心抗原放免检测结果表明,两种形式的ｃ基因的表达无明显差异．说明－３位是否为Ａ对ｃ基因在昆虫细胞中的表达量没有影响．     

黑麦B染色体显微切割和微克隆

显微分离出两条黑麦Ｂ染色体,经蛋白酶Ｋ处理,Ｓａｕ３ＡＩ酶切后,用ＬＡ－ＰＣＲ（ＬｉｎｋｅｒＡｄａｐｔｅｒＰＣＲ）方法进行扩增,得到０．２～２ｋｂ的ＤＮＡ片段．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析结果表明,此扩增产物来源于黑麦Ｂ染色体．将部分ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体中,获得了５０００个克隆．为构建Ｂ染色体ＤＮＡ文库奠定了基础     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

大肠杆菌（Escherichia coli）甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆

用聚合酶链式反应扩增了大肠杆甜菜碱醛脱氢酶基因，插入ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的Ｘｂａｌ和ＫｐｎＩ位点后转化大肠杆菌，得到了克隆，并亚克隆在植物双元表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，通过ＰＣＲ得到证实。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶原基因的初步研究

从桂北五步蛇毒腺中抽提蛇毒总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一试管内进行）扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,并进行电泳检测,可见３条特异的ＤＮＡ条带,分别约为１．５Ｋｂ、１．３Ｋｂ和８００ｂｐ,利用平端连接的方法将其中的８００ｂｐＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定。     

胎肝及肝癌组织中IGF—IR的表达研究

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从胎肝中克隆出ＩＧＦ－ＩＲβ严基的ｃＤＮＡ序列分析证明同已报道的人胎盘膜ＩＧＦ－ＩＲｃＤＮＡ顺序相同。提示ＩＧＦ－ＩＲ在胎肝的分化发育过程中具有生理意义。     

多聚酶链反应技术在淋病检测上的应用

本文应用多聚酶链反应（ＰｏｌｇｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术对直接涂片镜检淋球菌阴性患者１００例进行淋球菌ｃｐｐＢ基因片段测定。其中ＰＣＲ阳性者高达５４例，占５４％，该组病人中有２０例尖锐湿疣患者，其中ＰＣＲ阳性者１３例，占６５％。以上结果提示：ＰＣＲ技术可明显提高淋病患者的检出率。     

PCR用于孕牛外周血中胎儿SRY序列检测和奶牛早期胚…

根据文献报道的人、鼠，兔ＳＲＹ同源序列设计引物，从 在因组中扩增出一段牛特异的ＳＲＹ序列，对该序列进行克隆测序后高度出一对雄牛特异的ＰＣＲ引物，利用此引物对奶牛早期胚胎细胞和妊娠晚期母牛外周血ＤＮＡ样品进行ＰＣＲ扩增，经分娩牛犊性别验证，本引物能够准确鉴别孕牛外周血中雄性胎儿的ＳＲＹ序列，并且对早期胚胎性别鉴定的准确率８０％。