线粒体定位序列介导的绿色荧光蛋白基因在烟草中表达的分析

由于绿色荧光蛋白可在活组织或细胞中直接检出 ,因而近年已在转基因植物的研究中用作报告基因 ,这样可在植物生长的任何阶段进行活体筛选和鉴定。本研究利用线粒体定位序列对改良 gfp基因在转基因烟草中的表达进行了观察 ,结果表明 :将GFP直接在细胞质中大量表达会对植物细胞产生毒性 ,从而影响植物细胞的分化 ,而将其定位在线粒体中 ,则从转化细胞产生植株的频率明显增高。     

烟草维管束发育相关基因Nvas启动子顺式作用元件鉴定

为研究烟草维管束发育相关基因Nvas启动子顺式作用元件,将克隆得到的Nvas启动子ATG+1~-463区域分为10个不同长度的片段与GFP报告基因融合构建了植物表达载体并完成了5'端缺失分析.利用根癌农杆菌介导转化W38型烟草叶盘,得到了含有不同长度Nvas启动子片段的转基因烟草植株.体视显微镜下观察到含Nvas启动子-216~-463区域的转基因烟草均有绿色荧光蛋白的表达,表达部位集中在维管束组织.结果表明Nvas启动子能使外源基因在维管束组织中特异表达.该启动子活性高于Ca MV35S,在ATG+1~-216区域存在核心启动子元件,在-337~-379区域存在能增强启动子活性的元件.     

水稻中两个同源异型结构域转录因子的亚细胞定位

为了对水稻同源异型结构域转录因子HD-ZipⅢ家族中的HDZ1和HDZ2进行亚细胞定位,利用RT-PCR技术从水稻cDNA中扩增HDZ1和HDZ2的编码区(去除终止密码子序列),与绿色荧光蛋白GFP编码框融合,构建2个转录因子的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的转化方法转化至烟草中进行瞬时表达分析.结果表明:PCR扩增所得为目的基因片段HDZ1和HDZ2;二者与载体质粒pCAMBIA35S-GFP连接获得的融合表达载体成功移至烟草中并表达;确定HDZ1主要定位于烟草叶片的气孔中,而HDZ2定位于烟草表皮细胞的细胞膜上.二者在亚细胞中的定位不同,可能在水稻生长发育中所起的作用也不相同.     

NAC1启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NAC1上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NAC1启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达.进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导.初步说明NAC1基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因.     

NACl启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NACl上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NACl启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达．进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导．初步说明NACl基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因．     

番茄MSI2 like基因的克隆及功能初探

研究通过对番茄MSI2 like蛋白序列与其它模式植物的蛋白序列进行同源性比对, 发现番茄MSI2 like与马铃薯的同源性最高; 另外还预测了其蛋白质的理化性质及三级结构. 酵母双杂交实验证明, MSI2 like与UV Damaged DNA Binding Protein 1(DDB1)具有相互作用. 同时, 利用RNA干涉技术构建植物双元载体, 农杆菌介导法转化番茄得到转基因植株, 该转基因植株在干旱胁迫条件下有一定的抗旱功能. 再利用实时荧光定量PCR分析MSI2 like基因表达的组织差异性, 发现它在各个组织中都表达, 但是在生殖器官花中的表达量明显较其他组织高.     

拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位

为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-protein,AGP)的亚细胞定位,克隆了这个基因的编码区,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体,经农杆菌介导转化烟草BY-2悬浮细胞.利用激光扫描共聚焦显微镜,在稳定转化的BY-2细胞表面观察到绿色荧光.研究结果表明,此AGP分布在细胞膜表面.     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene,EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene,ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

油菜ICE1基因表达载体构建及转化烟草

从油菜中克隆得到了ICE1基因的开放阅读框序列.构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体,经农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株.通过PCR检测,目的基因成功转入烟草中.将转油菜ICE1基因的烟草和非转基因烟草置于2℃处理7 d,非转基因烟草出现萎蔫,转基因烟草没有明显变化,非转基因烟草丙二醛浓度明显高于转基因烟草.将转基因烟草与非转基因烟草分别置于0、-2、-4℃各1 h后,转基因烟草APX、SOD活性明显高于非转基因烟草.     

过量表达SlOPA3-like基因对烟草叶片叶绿体发育的影响

3型视神经萎缩蛋白(Optic atrophy type 3,OPA3)普遍存在于真菌、植物和动物中,但它在植物中的功能尚不清楚。本研究构建了番茄OPA3-like (SlOPA3L)基因的过表达载体35S∶∶SlOPA3L并遗传转化烟草。与野生型烟草叶片相比,过量表达SlOPA3L基因的转基因烟草的子叶呈花叶状、部分组织失绿,转基因烟草的少数早期真叶呈花叶表型,随着叶片发育后又逐渐恢复正常。转基因烟草的叶片细胞表型分析表明:真叶花叶的叶片的海绵组织和栅栏组织发育受到显著的影响。这些结果表明:Sl OPA3L基因可能影植物叶片细胞的分裂和参与植物叶片发育早期的叶绿体形成。     

拟南芥ACOS5基因表达模式分析

探讨了拟南芥ACOS5基因的表达模式.采用PCR方法对拟南芥col生态型基因组进行扩增,获得ACOS5基因启动子序列,将其连入p1300植物表达载体中以GFP作为报告基因,并将该载体通过农杆菌转基因转入拟南芥col生态型中,观察转基因植物花药中GFP的表达情况.结果:ACOS5::GFP转基因植物从花药发育第四期到十二期均有GFP表达,GFP的表达峰值在第八期.结论:该表达载体可用,且ACOS5基因从花药发育第四期开始有微弱表达,且随着时期发展逐渐增强,至第八期达到表达最高峰值,随后随时期发展表达量逐渐减弱.     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。     

几种诱导昆虫细胞RNA干扰质粒的构建和效果比较

构建了四种可以在昆虫细胞中表达形成dsRNA的质粒,比较了其诱导RNA干扰,抑制目标基因———绿色荧光蛋白(GFP)基因表达的效果.四种质粒都不同程度地抑制了质粒介导的GFP表达,其中尤以单个果蝇hsp70启动子表达反向重复序列,并带有杆状病毒AcMNPV增强子hr5的质粒效果最佳,使GFP表达量下降到原来的3.9%.当用于抑制由杆状病毒介导的GFP表达时,以两个相向排列的AcMNPV ie1基因启动子的构造有明显的抑制效果.这些结果对于在昆虫细胞中有效地利用RNA i研究基因功能有参考意义.     

特异性siRNA对大鼠肝星状细胞TIMP-1表达的影响

观察金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞株HSC-T6后TIMP-1基因表达的情况。构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6／TIMP-1 shRNA,利用该载体介导四个特异性和一个非特异性的TIMP-1 shRNA,分别为TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4和TIMP-1 shRNA—NON。采用阳离子脂质体介导法转染HSC-T6细胞,激光共聚焦显微镜观察GFP表达,荧光实时定量PCR方法检测TIMP-1 mRNA表达情况。质粒转染HSC—T6细胞后,激光共聚焦显微镜观察转染组细胞内均见绿色荧光,未转染组未见绿色荧光;mRNA水平检测显示：与正常对照组相比,TIMP-1 shRNA1、TIMP—1 shRNA2和TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达较强的抑制作用,尤TIMP-1 shRNA1抑制作用最强（P〈0．01）。pGCsi—U6介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制肝星状细胞中TIMP—1的表达。     

拟南芥HSP70基因启动子表达载体的构建及在烟草BY2细胞中的应用

探讨了拟南芥的HSP70基因在液体悬浮培养的烟草BY2细胞中的表达及应用.用PCR扩增的方法从拟南芥col生态型基因组中扩增获得HSP70基因启动子序列,将其连入p1300表达载体且以GFP为报告基因,将该表达载体采用农杆菌转基因转入液体悬浮培养的烟草BY2细胞中,观察转基因细胞中报告基因GFP的表达情况.结果显示:HSP70:GFP转基因液体悬浮培养的烟草BY2细胞中有GFP的表达.该表达载体可在液体悬浮培养的BY2细胞中正常表达,且可在较短时间内获得大量实验材料,对拟南芥的HSP70基因启动子的进一步研究提供理论依据和丰富的实验材料,且可明显缩短实验周期.     

根癌农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位研究

采用根癌农杆菌介导的方法,以受控于CaMV35S启动子的携带有GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1300-35S-GFP转化洋葱表皮细胞.荧光显微镜下观察结果显示,GFP基因在经浸染和共培养后的洋葱表皮细胞中得到了表达,绿色荧光分布在细胞核和细胞质中,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础.     

Prokaryotic expression and characterization of a pea actin isoform （PEAcl） fused to GFP

Actins widely exist in eukaryotic cells and play important roles in many living activities. As there are many kinds of actin isoforms in plant cells,it is difficult to purifyeach actin isoform in sufficient quantities for analysing itsphysicochemical properties. In the present study, apea(pisum Sativum L.)actin isoform (PEAc1)fused to His-tag at its amino terminus and GFP(green fluorescent protein)atits Carboxyl terminus were expressed in E. coli in inclusionbodies. The fusion protein (PEAc1-GFP)was highly purifiedwith the yield of above 2 mg/L culture by dissolving inclu-sions in 8 mol/L urea,renaturing by dialysis in a gradient of urea,and affinity binding to Ni-resin. The purified mono-meric PEAc1-GFP could efficiently bind on DNase I andinhibit the latter抯 enzyme activity. PEAc1-GFP could po-lymerise into green fluorescent filamentous structures(F-PEAc1-GFP),which could be labelled byTRITC-phalloidin,a specific agent for observing microfila-ments. The PEAc1-GFP polymerlzation curve was identicalwith that of chicken skeletal muscle actin. The critical con-centration for PEAc1-Gfp to polymerise into filaments is 0.24 μmol/L.The F-PEAc1-GFP could stimulate myosinMg-ATPase activity in a protein concentration dependantmanner (about 4 folds at 1 mg/mL F-PEAc1-GFP). The re-sults above show that the PEAc1 fused to GFP retained theassembly characteristic of actin, indicating that gene fusion,prokaryotic expression, denaturation and renaturation,andaffinity chromatography is a useful strategy for obtainingplant actin isoform proteins in a large amount.     

紫花苜蓿转录因子MsDREB1基因表达产物的亚细胞定位

利用生物信息学方法对紫花苜蓿MsDREBl进行了生物信息学分析．结果表明,该序列舍有AP2典型结构域,在N端存在核定位信号．为进一步验证该基因功能,构建MsDREBl与绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP）基因融合的植物表达载体pCAMBIAl302-MsDREBl,再利用基因枪将其转入洋葱表皮细胞,在共聚焦扫描显微镜下观察MsDREBl基因表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位．结果表明,MsDREBl基因表达产物定位于细胞核中,符合DREB家族转录因子特性．