利用mRNA差异显示技术筛选绵羊毛性状相关基因

利用mRNA差异显示技术（DD-PCR）,比较绵羊肩、腹、腿三部位皮肤中mRNA的差异表达,共获得差异表达的cDNA片段16条,其中肩部、腹部与腿部之间的差异较大;对所有16条差异片段进行测序并在GENBANK中进行检索,未发现有同源序列.提示16条cDNA片段可能为未发现的基因片段,也可能存在假阳性片段.     

以mRNA差异显示法分离牙鲆白化相关基因的初步研究

以正常和白化牙鲆表皮组织总RNA为模板,用Oligo d(T)13M(M分别为A、C、G)3种锚定引物和26种差异显示随机引物组合进行差异显示,PAGE凝胶电泳后,用新型高灵敏度核酸荧光染料SYBR GREEN I显示差异DNA条带,得到区分度较好的差异表达图谱,共分离49条牙鲆白化相关DNA片段,片段长度260～800bp左右,经克隆测序后将可作为新的ESTs进行同源序列比较.     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

棉花耐旱相关基因的cDNA-AFLP差异显示

为鉴定棉花干旱胁迫响应基因,应用cDNA-AFLP技术,以棉花耐旱品种晋棉13号幼苗为研究对象,对干旱胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过64对引物组合的筛选,共分离得到232个差异表达的转录衍生片段(TDFs),对其中102个TDFs进行了克隆、测序和序列分析。结果表明:45个TDFs与NCBI中已有序列同源,功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有57个TDFs无同源序列或同源性低,预测其为是一些未知功能基因。     

用差异显示技术分离空心莲子草抗旱相关基因

采用mRNA差异显示技术,分离空心莲子草在干旱胁迫1 d后差异表达的基因,获得139个基因片段.经过Reverse Northern检测,初步证实有两个片段受干旱诱导表达上调.对其中一个片断克隆测序并进行核甘酸序列比对,显示与其他基因同源性都很低,表明可能是新的基因.半定量PCR技术证实该基因受干旱诱导表达上调.     

用mRNA差异显示技术分离盐胁迫下小麦耐盐相关cDNA

目的用mRNA差异显示技术分离小麦盐胁迫应答cDNA,为进一步研究小麦耐盐机理奠定基础。方法将小麦(Triticum aesticum L.)耐盐品系宝丰7228r种子分别置于含NaC l 0‰和12‰的Hoagland培养液中生长,7d后分别取叶片,提取总RNA并分离出其中的mRNA,通过锚锭引物O ligo dT10GC反转录和9个10核苷酸随机引物进行PCR扩增。结果DDRT-PCR结果显示,有4个差异DNA片段只在盐胁迫的小麦耐盐品系基因组中表达,而在对照中没有出现。这4个差异cDNA片段分别命名为ts01(260 bp),ts02(330 bp),ts03(420 bp),ts04(600 bp)。4个差异cD-NA片段的RNA杂交结果显示,只有ts04存在明显差异,在盐胁迫条件下有杂交斑点而在对照中没有杂交斑点,其余3个cDNA片段在盐胁迫和对照中都没有杂交斑点。进一步将ts04克隆并进行DNA序列测定及同源性分析。结论ts04可能是耐盐相关cDNA片段,该片段核酸序列与麦属抗性相关的肌动蛋白基因有23%同源。     

用差异显示反转录PCR银染技术研究小鼠前胃癌相关基因

目的:以N-亚硝基-肌氨酸乙酯(NSEE)作为诱变剂建立NIH小鼠前胃癌动物模型,研究小鼠前胃癌差异表达基因,探索细胞癌变的分子机理.方法:采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)、反向Northern点杂交、克隆、测序和生物信息学分析等方法,对其癌变组织中差异表达的基因进行系统的研究分析.结果:得到5条在小鼠前胃正常对照组织、癌变组织之间差异表达的cDNA片段.筛选后,对其中3个差异条带进行DNA序列测定,有1个与已知基因Tpt1高度同源,2个与同1基因片段AK085193.1高度同源.提示这2个基因与小鼠前胃癌的形成有关.     

法夫酵母银染mRNA差异显示技术的建立

对影响银染DDRT-PCR方法的主要因素如RNA投入量、引物浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度以及二次扩增的退火温度进行优化.实验结果表明:适宜分析法夫酵母mRNA差异显示的银染DDRT-PCR的条件是总RNA投入量为0.4 μg、引物浓度为1.5 μmol/L、dNTPs浓度为0.25 mmol/L、MgCl2浓度为1.7 mmol/L、二次扩增的退火温度为40 ℃.     

干旱胁迫下甘蓝型油菜相关抗旱基因的表达分析

以抗旱性较强的甘蓝型油菜Holiday为材料,在开花初期对油菜进行干旱胁迫处理,采用RT-qPCR技术分析ABA2、BnSOS2、BnCS、CAM、CBF4、PIP1这6个油菜抗旱相关基因在干旱胁迫第1天、3天、5天、7天在根、茎、叶、花和青荚中的表达量.结果表明,干旱胁迫下,6个抗旱相关基因在油菜的不同器官中均出现了上调表达;在不同干旱胁迫下,各基因表达量呈现不同的变化趋势;在相同的器官中,各基因的表达量存在明显的不同,累积表达量表现为根中ABA2最大、CBF4最小,茎中CAM最大、CBF4最小,叶中PIP1最大、ABA2最小,花中CBF4最大、BnSOS2最小,青荚中BnCS最大,CBF4最小.说明植物在受到干旱胁迫时,不同的抗旱途径对干旱胁迫的响应程度是不同的;不同器官中各抗旱相关基因与胁迫时间的相关性分析表明,CAM基因在茎中的表达量、CBF4基因在花中的表达量与胁迫时间呈显著正相关.     

植物基因差异表达的研究方法及进展

对目前在植物基因差异表达研究领域主要采用的消减杂交,DDRT-PCR,cDNA-RDA,cDNA-AFLP,SSH,基因芯片和SAGE等研究方法的原理、特点、研究进展以及发展趋势进行了综述.这些方法各有特点,可根据研究工作的需要选择合适的研究方法.     

一种改进的基因表达数据分类方法

从分类算法和特征基因选择两个方面研究基因表达数据的分类,将传统的Support Vector Machines(SVM)算法和K-nearest neighbor(KNN)算法两者结合成为一种应用于基因表达数据分类的算法,并针对基因表达数据分类数据集“样本少,维数高”的特点,提出了一种改进的基于相关性的递归特征消除算法(简称为C-RFE),消除了数据冗余．实验结果表明,新方法可有效提高分类准确率和特征选取的效率．     

鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎发育特异表达基因的初步筛选

利用mRNA差异显示技术，对入孵67～91h的鸡（♀）与鹌鹑（♂）杂交种胚胎中mRNA差异表达进行比较，筛选出与杂交种胚胎早期发育相关的特异表达基因，并克隆测序这些序列，分析这些基因在杂交受精蛋早期胚胎发育中的作用，及其对杂交种早期胚胎死亡是否有影响。分析结果表明，已经获得6个杂交种孵化不同时期的基因片段与鸡的mRNA序列具有高度同源性。其中，孵化第72h时胚胎mRNA表达的序列与鸡雌激素受体结合位点相关抗原mRNA具有高度同源性，孵化第79h时产生的差异片段经过比对，发现：与鸡（♀）肽酰-脯氨酰异构酶类似的mRNA序列具有高度同源性。而杂交种胚胎发育到第72h时，可检测到鸡雌激素受体结合位点相关抗原mRNA的表达，比前人所得到的表达时间（胚胎发育在第84h时检测到）提前了12h，这很可能是造成杂交种早期胚胎大量死亡的原因之一。     

mRNA差异显示法筛选和克隆东亚飞蝗抗药性相关基因

筛选和克隆东亚飞蝗抗药性相关基因.采用mRNA差异显示法(mRNA diffFerential display PCR,DD-PCR),对比了东亚飞蝗在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导前后,基因表达发生的变化.对差异片段进行了回收,克隆、测序,Northern点杂交验证以及序列分析和同源性比较.东亚飞蝗在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导前后,存在明显的基因表达差异,发现差异表达条带9条,对9条差异表达条带进行克隆、测序,经序列分析和同源性比较和RNA点杂交验证,表明确认其中1条带与东亚飞蝗的抗药性有关.东亚飞蝗的mRNA差异显示证明,该EST序列可能在抗药的发生发展中具有一定的作用.     

银染差异显示方法的建立及其条件的优化

mRNA差异显示技术是辨析差异表达基因的强有力的工具。本实验旨在优化无同位素的银染差异显示方法。以总RNA为模板，反转录成cDNA，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用银染的方法显示cDNA条带，其结果为：RNA模板在2μg以上时，可以扩增出较多的条带，而低于1μg时条带数目减少；在38～40℃范围内，40℃扩增的条带多而清晰；优化银染程序。     

太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因初探

将搭载于“神舟四号”飞船飞行返地后的宫颈癌Caski细胞进行单克隆化,筛选出生长速度快于对照组、编号为44F10的细胞克隆,G1期细胞减少,S期细胞增多,成瘤能力增强;编号为48A9的细胞克隆细胞学行为与之相反,与对照组差异均有显著性(P<0.05)。为了解太空诱变肿瘤细胞生物学行为改变的机制,从分子水平入手研究经太空诱变的宫颈癌细胞和地面对照细胞的差异表达基因。应用含2747个人类肿瘤相关基因的Oligo双通道芯片研究差异表达基因。分别抽提44F10、48A9组和地面对照细胞的总RNA,逆转录cDNA并标记探针。将实验组和对照组cDNA探针混合,分别与同一张芯片杂交后,用不同的波长扫描荧光强度,从而筛选出差异基因。44F10组有16个基因呈现差异表达,48A9组有36个基因呈现差异表达。差异性表达主要涉及细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期调控和信号转导的基因。促进细胞增殖的基因在44F10组中表达上调,而在48A9组中限制细胞增殖的基因表达上调。研究表明,太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因导致了细胞生物学行为的改变。     

基因表达数据聚类中模糊核算法的改进

FCM算法在基因表达数据分析中存在噪声点，影响聚类结果，为此提出了一种改进的模糊核聚类算法，通过使用Mercer核把原始数据映射到高雏特征空间，并为特征空间的每个向量分配一个动态权值，分析权值的大小来识别噪声点，得到一个较为理想的聚类结果：实验结果表明，该方法比FCM聚类算法具有更好的聚类效果．