褐飞虱喂养试验显示表达GNA的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有3个不同基因（hpt,gus和gna）的质粒pWRG1515和pRSSGNA1共同转化粳稻品种鄂晚5号成熟胚诱导的愈伤组织。共再生出35株独立转基因植株。PCR／Southern印迹法分析发现,83％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western印迹法分析发现79％的含gna基因的转基因植株以不同水平表达GNA。遗传分析证实外源基因在转基因植株后代中以孟德尔方式遗传。从其R1代亲本为孟德尔3：1方式遗传的R2代中,鉴定出2个含有所有3个外源基因的独立转基因植株纯系。这些纯系具有相似的外源基因表达量。褐飞虱喂养试验表明,这些纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用。这些褐飞虱抗性提高的转基因纯系将应用于水稻抗虫育种中。实验证明,通过遗传转化和筛选可获得含在农业上有应用价值基因的转基因水稻纯系。     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

辣椒的离体再生及抗虫基因转化的研究

研究建立起一套简单、高效的辣椒遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导带柄子叶,将豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI)基因转入辣椒栽培品种“益都羊角椒”中。对获得的33株卡那霉素（Km)抗性植物进行PCR检测,证明有6株为转CpTI基因植株。通过对转基因植株进行抗虫性研究,发现R1代植株对棉铃虫表达出一定的抗性,但不同转化体之间其抗性存在着差异。     

含编码类铁氧还双亲性蛋白ap1基因的转基因水稻植株的获得

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因（hpt),gusA报告基因和ap1基因的2个质粒（pJIMB15和pBiSAP1)共同转化同转化由粳稻品种鄂宜105号种 子在胚诱导的愈伤组织（2－3周龄）。ap1基因编码一种双亲性的蛋白。该蛋白能延缓因假单孢菌感染所引起的非寄主植物中的过敏反应。经过2轮潮霉素（30mg/L)筛选,抗性愈伤组织被转入含30mg/L潮霉素的再生培养基中再生植株。从轰击的186块愈伤组织中共再生出32株独立的转基因水稻植株（转化率为17．2％）,PCR／Southern blot分析显示84％的转基因植株含有所有3个基因。     

抗除草剂基因atzA在转基因水稻中的遗传

研究了细菌阿特拉津氯水解酶基因atzA在转基因水稻AA269株系自交和回交后代中的遗传规律．结果表明：atzA基因作为一个显性遗传位点遵循孟德尔遗传分离规律．除草剂抗性鉴定结果表明,在T1代水稻群体中除草剂抗性和敏感株数遵循3：1的分离规律,T2代稳定纯合;T2～T7自交世代的转基因植株均保持稳定的除草剂抗性．在BC1～BC3代群体中除草剂抗性和敏感株数遵循1：1的分离规律,BC群体自交的BCF2群体中遵循3：1分离规律．分别对AA269／9311的B3F1和B2F2群体中的一个株系进行了PCR分析,PCR阳性株与阴性株的分离比例分别符合1：1和3：1,与除草剂抗性鉴定结果一致．对T7代群体中部分单株的Southern杂交和RT—PCR分析表明,atzA基因已稳定遗传至T7代,并得到表达．     

复苏植物牛耳草BhLEA2基因启动子的分离和基因表达模式研究

为研究干旱诱导的基因表达模式,利用Inverse-PCR和Tail-PCR的方法从复苏植物牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R Br．）中扩增出胚胎发育晚期丰富蛋白编码基因BhLEA2的1215bp启动子序列,命名为PBhLEA2。构建了由PBhLEA2启动子引导GUS嵌合基因的植物表达载体pBhLEA2-GUS,并经农杆菌介导导入到烟草中,得到4株转基因烟草植株。GUS检测分析表明,该启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的种子和刚萌发的小苗的子叶和胚轴中高效表达,在10-20d苗龄的植株中不表达,表现出一定的发育阶段和组织特异性。干旱、高盐胁迫及脱落酸（ABA）、乙烯和H2O2等信号分子可在不同程度上诱导GUS报告基因在20d苗龄的转基因植株的叶片中表达,但只有ABA可诱导其在根中表达,表明该启动子对BhLEA2基因表达的调控受环境信号影响。     

根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

农杆菌介导的双价抗虫基因对番茄遗传转化的研究

采用农杆菌介导法将含有苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(CryIAc)与半夏凝集素抗虫基因(Pta)的高效植物表达载体pCAMBIA3300转入番茄品系Micro Tom的子叶外植体中。经过共培养、除草剂筛选和分化再生,获得了24个具有除草剂抗性的株系。再将转化后的番茄植株经过PCR检测和Southern Blot检测,确定检测后呈阳性反应的株系为8个。通过小菜蛾幼虫初步抗性试验证明,转基因株系表现出较强的抗虫性。实验结果为进一步研究番茄抗虫性和培育抗虫番茄新品种奠定了重要基础。     

稻瘟病抗性基因 Pi63 启动子4 个构建体的表达及抗性分析

利用农杆菌介导法获得带有不同长度启动子区域的稻瘟病抗性基因Pi63全长基因的转基因水稻,并采用实时荧光定量PCR方法鉴定了T1代阳性植株的基因拷贝数,进一步测定了单拷贝转基因植株在接种稻瘟病菌前后Pi63基因的表达量变化.结果表明:接种后4个分别带有不同长度启动子的Pi63转基因植物T1代中Pi63基因的表达量均升高,其抗病相关的顺式作用元件处于P1与P2中间的区域,P0到P1的区域存在负调控元件.此结果可为进一步揭示水稻稻瘟病抗性基因Pi63的分子机理奠定基础.     

基因枪法获得可育抗除草剂转基因小麦

用基因枪法对两个春小麦品种进行了遗传转化，获得１９株独立转化的，抗除草剂Ｂａｓｔａ的小麦植株，其中１５株自交可育，ＰＣＲ和ＤＮＡ印迹检测证实了该基因在转化植株中的表达，转基因及其表达已遗传到子三代，在已检测的７个转基因后代中，有４个植株其抗除草剂性状以单位点，显性性状的孟德尔方式遗传。     

农杆菌介导GNA基因对水稻的遗传转化

在ｐＣＡＭＢＩＡ３３００质粒中插入带有ＲＳｓ－１启动子的ＧＮＡ基因,并利用农杆菌介导的遗传转化将其导入水稻的微不定芽受体,得到了再生植株。ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ的检测结果初步证明ＧＮＡ基因已经整合到水稻的基因组中并得到表达。     

单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建

来自于啤酒酵母2?μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统可用于转基因植物（细胞）筛选完成后去除选择标记基因.水稻肌动蛋白actin基因启动子和玉米泛素ubiquitin基因启动子可有效驱动单子叶植物中外源基因的转录.为培育去除选择标记基因的抗盐耐旱单子叶转基因植物，构建了适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统. 该系统由含有FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA3300 Ubi FLP bar和含有frt位点的植物双抗（抗除草剂、抗盐耐旱）表达载体pCAMBIA1300 Ubi TsPPase frt als frtm以及pCAMBIA1300 Actin1 AtNHX1 frt als frtm组成.     

转基因水稻纯系对褐飞虱的抗性研究

利用基因枪法将含潮霉素抗性基因、ＧＵＳ报告基因和雪花莲凝集基因的２个质粒ｐＷＲＧ１５１５和ｐＲＳＳＧＡ１共同转化粳稻品种鄂宜１０５的成熟胚诱导的愈伤组织,从轰击的１５２块愈伤组织中共再生出２６株独立转基因植株,ＰＣＲ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法分析发现,７３％的转基因植株含有所有３个外源基因,遗传分析证实外泊基因在转基因植株后代中以孟德尔方式遗传,从其Ｒ１代亲本为孟德尔３：１方式遗传的Ｒ２代中,鉴定出     

根癌农杆菌介导苜蓿体胚转化及转基因植株再生

用含质粒载体pCAMBIA2301(带有受CaMV35S启动子调控的GUS基因和nptⅡ基因)的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens转化晋南苜蓿Medicago sativa L.cv.Jinnan的体胚组织,发现负压处理有利于提高转化频率(可达35%),3批共158个体胚切块的转化实验共获得具有卡那霉素抗性的再生植株15株,经组织化学染色和分子检测,证实GUS基因已整合到转化植株基因组中,在芽、叶片、叶柄和根等组织中均有表达,并在土壤栽培过程中保持稳定的表达.     

Transgenic rice homozygous lines expressing GNA showed enhanced resistance to rice brown planthopper

Mature seed-derived calli from two elite Chinese japonica rice (Oryza sativa L.) cultivars Eyi 105 and Ewan 5 were co-transformed with two plasmids, pWRG1515 and pRSSGNA1, containing the selectable marker hygromycin phosphotransferase gene (hpt), the reporter β-glucuronidase gene (gusA) and the snowdrop (Galanthus nivalis) lectin gene (gna) via particle bombardment. 61 independent transgenic rice plants were regenerated from 329 bombarded calli. 79% transgenic plants contained all the three genes, revealed by PCR/Southern blot analysis. Western blot analysis revealed that 36 out of 48 gna-containing transgenic plants expressed GNA (75%) at various levels with the highest expression being approximately 0.5% of total soluble protein. Genetic analysis confirmed Mendelian segregation of transgenes in progeny. From the R2 generations whose R1 parent plants showing 3:1 Mendelian segregation patterns, we identified five independent homozygous lines containing and expressing all the three transgenes. Insect bioassay and feeding tests showed that these homozygous lines had significant inhibition to rice brown planthopper (Nilaparvata lugens, BPH) by decreasing BPH survival and overall fecundity, retarding BPH development and declining BPH feeding. These BPH-resistant lines have been incorporated into rice insect resistance breeding program. This is the first report that homozygous transgenic rice lines expressing GNA, developed by genetic transformation and through genetic analysis-based selection, conferred enhanced resistance to BPH, one of the most damaging insect pests in rice.     

转蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST）以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中，构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中，PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株，RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达. 对T₀代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明，干旱胁迫6d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照，叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢. 对转基因植株叶片糖分分析表明，转基因烟草植株积累果聚糖，并在干旱胁迫后含量明显增加，而未转基因对照植株不积累果聚糖. 在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半；在附加200mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制，而转基因烟草根的生长发育正常. 以上研究结果表明，转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.     

拟南芥AtGluRS相互作用蛋白质VDAC及其转基因植物表型分析

电压依赖性阴离子通道蛋白质(voltage-dependent anion channel,VDAC)是拟南芥谷氨酰tRNA合成酶(AtGluRS)相互作用的蛋白质．为了研究VDAC蛋白的功能和作用,通过构建VDAC稳定表达载体,农杆菌介导的方法转化拟南芥,筛选和鉴定出VDAC过量和抑制表达植株．研究结果证实VDAC的过量和抑制表达植株影响气孔关闭和种子萌发．VDAC的过量表达导致植株对ABA敏感,VDAC的抑制表达降低了植株对ABA的敏感性．推测VDAC蛋白可能参与ABA信号途径．     

一种带有表型标记基因的诱导型抗旱植物表达载体的构建

为了克服组成型表达转录因子基因影响转基因植物性状的缺点,并构建一种具有级联放大作用并带有表型标记的诱导型植物双价表达载体。研究采用PCR方法从拟南芥克隆获得冷诱导转录因子CBF3基因,蜡质合成相关WIN1基因,干旱诱导RD29A基因启动子和冷诱导的LEA14基因启动子,并用CBF3转录因子所调控的下游RD29A基因启动子和LEA14基因启动子分别驱动CBF3基因和W1N1基因表达,构建了双价植物表达载体RD29AP-CBF3／LEA14P—WIN1／pcAMBIA2201。我们预测在转基因植物中,该表达系统可在干旱等逆境信号存在条件下,通过级联放大的方式诱导表达,在增加植物抗逆性的同时,增加叶片表层蜡质的积累,从而易于表型识别。本研究为利用花粉管通道法转化棉花,提高抗逆转基因棉花田间筛选的效率奠定了基础。