新型DNA聚合酶Tgo的扩增忠实性测定

用分子克隆技术从Thermococcus gorgonarius克隆并表达重组Tgo DNA聚合酶， 得到纯化的热稳定Tgo DNA聚合酶. 利用重组酶成功扩增了质粒pUC19、 野大麦Na⁺/H⁺逆向运转蛋白基因、 小鼠Cx37基因和人CYT2C9基因. 该酶的扩增性能与Taq酶相当， 而扩增忠实性分别比Taq酶、 Pfu酶高30倍和1.6倍.     

重组TgoDNA聚合酶的特性

检测了重组Tgo酶的扩增性能、 耐热性以及长距离PCR能力， 结果表明, 该重组酶扩增性能与Taq酶相当； 其耐热性极强， 在 95 ℃ 40 min， 仍具有很强的聚合活性； 利用重组酶在常规PCR条件下， 成功扩增了5.3　kb的拟南芥Timeless基因片段.     

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.     

用荧光双链引物特异扩增并定量核酸

描述了一种利用特殊的双链引物－－突触引物，用于核酸扩增的特异定量检测，在传统的引物的5'端标记荧光物质，而在引物的互补序列的3'端标记荧光淬灭剂以封闭其延伸。二者杂交即成双链突触引物。在制备PCR反应混合物阶段以及加热的初期，突触引物保持稳定的双链结构而不能引导扩增，在退火阶段，突触引物部分解链导致引物延伸，荧光物质与淬灭剂分开而产生荧光。利用人β珠蛋白基因对此方法进行了验证。这种可自行退火的荧光引物不仅简单地实现了实时扩增，同时比常规的热启动PCR更有效地提高了扩增的特异性。     

耐热DNA聚合酶介导的DNA酶促自发合成

构建了无模板引物的“类ＰＣＲ体系”。该体系在适当温度保温一段时间之后，能检测到产物出现，利用热变性分析等手段，初步研究了产物的性质，发现这些产物是随机合成的具有一些特殊构型的ＤＮＡ。本文报道三种构型，两类碱基组成比例，并通过改变反应条件观察对酶促自发合成的影响，探讨耐热ＤＮＡ聚合酶的非特异聚合活性以及介导的酶促自发合成的机理和意义。     

滚环DNA扩增的原理、应用和展望

滚环DNA扩增(Rolling circle DNA amplification,RCA)是一种等温信号扩增方法,其线性扩增倍数为10^5,指数化扩增能力大于10^9,产生的扩增产物连接在固相支持物(如玻片、微孔板等)表面的DNA引物或抗体上(适宜作生物芯片研究)。RCA是一种适合在芯片上(on-chip)进行信号扩增的新技术,它既能提供研究分析的敏感性和特异性,又能保持立体分析的多元性。RCA亦是一种痕量的分子检测方法,可用于极其微量的生物大分子和生物标志的检测与研究。,     

核酸扩增技术的原理及应用

本文对核酸扩增的几个方面,即聚合酶链式反应、连接酶链反应和Qβ复制酶技术等这几种技术的原理和用途分别作了介绍。     

二甲亚砜在聚合酶链反应扩增载脂蛋白E基因中的作用

目的：探讨二甲亚砜（DMSO）在聚合酶链反应（PCR）中扩增人类载脂蛋白E基因中的作用。方法：在不同质量分数DMSO的存在下,以PCR技术增人类载脂蛋白E基因片段。限制性内切酶酶切检测扩增产物。结果：在质量在分数5%-10%的DMSO下,可以成功地扩增到人类载脂蛋白E基因的第4外显子片段。结论：在DMSO作用下,PCR扩增增强了特异性。扩增的人类载脂蛋白E基因片段可以进行基因限制性片段多态性的分析。     

环介导等温基因扩增技术在林木病害检测中的应用展望

森林病害主要是由病毒、细菌、真菌和寄生性生物引起的,其中真菌所致病害种类最多,约占森林病害的80%以上。环介导等温基因扩增(LAMP)技术是一种快速高效的DNA扩增方法,具有简单、快捷、特异性强、准确性高等特点,笔者论述了LAMP技术的原理及其在病毒、细菌、真菌和寄生性生物等方面的应用及研究。该技术广泛应用于食品、临床、环境、农业、工业和畜牧业等领域。环介导等温扩增技术为快速分子检测提供了一条新的途径,在林木病害检测领域将会有广阔的应用前景。     

通过DNA聚合剪切放大体系提高RNA的检测灵敏度

基于循环的DNA剪切循环放大分子机器构建了一个RNA传感器。该分子机器以RNA为输入,产生大量的DNA片段,并替换报告探针上的荧光DNA从而产生荧光信号,实现对靶RNA浓度的放大检测。本分子机器分为两部分,反应部分和报告部分。在反应部分,以靶RNA为输入条件,以一个特殊设计的探针为反应模板引发一个自发连续的DNA聚合-剪切反应网络,重复产生大量信号DNA链;这些信号DNA链进入报告部分,通过杂交替换反应从一个报告探针上替换下带有荧光DNA序列,释放到溶液中。这样通过剪切产生的大量DNA适体序列被释放到溶液中,并替换报告探针上的荧光DNA,实现信号的放大。     

食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

食品及其原料中沙门氏菌的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.根据沙门氏菌invA基因核苷酸序列设计一组引物,应用环介导等温扩增技术（LAMP）,分别对7种不同血清型沙门氏菌和4种非沙门氏菌进行扩增,同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型,比较了LAMP法与活菌计数检测的敏感性.结果表明,该方法仅对沙门氏菌产生特异性扩增,灵敏度高达336,mL-1,食品样品经细菌富集培养后,检测灵敏度高达8.25,g-1.所建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于沙门氏菌污染食品的快速检测.     

直接法提 取血清DNA后套式聚合酶链反应扩增乙肝病毒DNA

为进一步提高ＨＢＶＤＮＡ检测水平，改良了直接法提取血清ＤＮＡ技术，并用套式聚合酶链反应扩增ＨＢＶＤＮＡ。即以裂解液直接提取血清ＨＢＶＤＮＡ，用内外两对引物分别进行连续两次扩增。     

Klenow大片段聚合酶及T4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用

利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5＇→3＇聚合酶活性和T4DNA聚合酶3＇→5＇外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST.用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3＇凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3＇凸端削平.在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆.结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中.     

东方蜜蜂微孢子虫环介导恒温扩增检测方法的建立

以从重庆酉阳分离到的东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)为研究对象,以该物种16SrDNA作为靶标,设计引物并采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测东方蜜蜂微孢子虫。实验结果显示,LAMP检测的最佳条件为内引物浓度5μmol·L-1,聚合酶用量800U;以研究对象16SrDNA质粒为模板,LAMP检测的最低质量浓度为1.735×10-2ng·μL-1,PCR检测的最低质量浓度为1.735×10-1ng·μL-1;以研究对象基因组DNA为模板,LAMP检测的最低质量浓度为1.475×10-3ng·μL-1,PCR检测的最低质量浓度为1.475×10-1ng·μL-1;以研究对象基因组DNA、正常中蜂(Apis cerana)中肠基因组DNA、正常意蜂(Apis mellifera ligustica)中肠基因组DNA、正常家蚕(Bombyx mori)中肠基因组DNA、蜜蜂球囊菌(Ascosphaera a pis)孢子基因组DNA和中蜂囊状幼虫病毒cDNA作为模板进行检测,其中只有以研究对象基因组DNA为模板时,LAMP扩增才有条带。以上研究提示具有高灵敏度和高特异性的LAMP检测方法是东方蜜蜂微孢子虫检测的一个有效工具,可为后期在养蜂场建立快速有效的检测工具奠定基础。
     

重组Pol D DNA聚合酶的纯化及其功能初步研究

为研究古菌Pol D DNA聚合酶两个亚基的功能及其相互作用,对重组超嗜热硫还原古菌Thermococcus sp.4557 Pol D DNA聚合酶小亚基DP1和大亚基DP2进行柱层析纯化,采用荧光标记核酸结合聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对两个亚基体外功能进行研究。结果表明,DP2具有DNA复制延伸活性,DP1具有3′→5′外切核酸酶活性;DP1在与DP2的浓度比高于0.3∶1时可降解DP2的延伸产物;DP2对DP1的外切核酸酶活性有促进作用,Sld5和Psf1蛋白复合体(Sld5 and Psf1 Complex, GINS 51)对DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。古菌Pol D DNA聚合酶大小亚基的功能及其相互作用对DNA复制机制的进一步认识有借鉴意义。     

食品中蜡样芽胞杆菌实时荧光RPA检测方法的建立与应用

为实现简便快速地检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),根据GenBank中蜡样芽胞杆菌16S RNA序列设计特异性引物和exo探针,建立了一种实时荧光重组酶聚合酶扩增方法,在39℃恒温下仅需20min即可完成检测。该方法特异性扩增蜡样芽胞杆菌16S RNA基因片段,对其他芽胞杆菌和非芽胞杆菌无扩增;以蜡样芽胞杆菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.0×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染实验表明,当大米饭中蜡样芽胞杆菌污染量≥1.5×10⁴CFU/g时,即可通过real-time RPA方法检出,所需时间仅为6～13min;而当污染量≥1.5×10⁵CFU/g时,才能通过real-time PCR方法检出,所需时间至少为30min(Ct值为20～31)。     

环介导等温扩增技术检测乳粉中肺炎克雷伯菌

以荚膜脂多糖(capsular polysaccharide,CPS)合成调控子resA为靶基因片段,设计了肺炎克雷伯菌特异性引物,建立了环介导恒温扩增技术(Loop-Mediated lsothermal Amplification,LAMP)检测方法.结果表明,3对LAMP引物对肺炎克雷伯菌不仅有菌种专一性,而且,具有相当高的灵敏度(2 CFU/100 g).因此,该方法有利于更快更准确的鉴定食品中肺炎克雷伯氏菌.     

环媒恒温核酸扩增法在病原微生物鉴定中的研究应用

环媒恒温核酸扩增（LAMP）反应,是分子生物学领域中的一个新概念,它可以在恒温（60-65℃）条件下,30-60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到10^9水平．该方法的一大特色是,可以通过反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在．因此,对于病原微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点．本文重点论述了目前LAMP方法的原理以及在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断以及水产养殖等领域的应用及研究情况．表明,该方法已具有成功应用的现实性,为快速基因检测提供了一种新的技术途径;比PCR方法更具推广性,可望作为常规检测工具．     

猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测

为了鉴别猪瘟病毒（CSFV）野毒感染和疫苗接种,系统比较分析CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异,设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的环介导等温扩增（LAMP）引物,建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法.LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂或者琼脂糖凝胶电泳进行检测.该方法特异性好,比RT-PCR灵敏度高出1 000倍,且重复性稳定性良好,为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法.