TIR突变的hbFGF在原核系统中高效的表达

目的：为获得非融合高表达hbFGF的大肠杆菌表达系统；方法：设计PCR引物，将hbFGF的5’端前10个密码子突变，优选大肠杆菌较偏好的密码子并降低G C含量，通过双酶切法将突变后的hbFGF克隆人pBV220质粒载体中，筛选出重组子，再通过温控法对重组菌体进行诱导，分析表达情况，并进一步纯化和测活；结果：bFGF在该系统中高水平表达，表达量超过30％，其中绝大部分形成包涵体，经过包涵体变复性等纯化步骤后测活性，证明有生物活性；结论：TIR区域的基因突变对hbFGF在pBV220中高效表达起到关键作用。     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

封闭Her—2蛋白拮抗碱性成纤维细胞生长因子对人肝癌细胞的粘连效应

目的：探索碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth,bFGF）影响癌细胞粘连的信号传递途径,提供抗癌治疗的线索。方法：以人肝癌细胞系（HepG2）为靶子,明确靶细胞存在Her-2蛋白表达的同时,利用Her-2蛋白抗体封闭靶细胞Her-2蛋白来研究bFGF作为配体与否的细胞粘连效应性。结果：靶细胞HepG2确实具有Her-2蛋白表达;利用抗体封闭靶细胞Her-2蛋白时,靶细胞明显地呈现拮抗bFGF作为配体的细胞粘连加强效应。结论：bFGF对人肝癌细胞粘连性的影响与Her-2基因蛋白介导的信号传递作用有关。     

甲基乙二醛诱导牙周膜成纤维细胞基因表达与分析

运用基因芯片研究甲基乙二醛诱导人牙周膜成纤维细胞基因表达谱的变化。原代培养人牙周膜成纤维细胞,诱导组以终质量浓度为0.1 g/L的甲基乙二醛刺激培养细胞,对照组不含甲基乙二醛。24 h后收获细胞,提取mRNA,逆转录cDNA时用Cy3和Cy5荧光染料标记,制备成cDNA探针,与表达谱芯片进行杂交、扫描和分析。芯片检测结果用实时定量聚合酶链反应验证和生物信息学分析。结果共有18条基因显著差异表达,其中上调基因有11条,下调基因有7条,差异性表达的基因按功能可分为程序性细胞死亡、信号转导、细胞因子、代谢酶类、载体蛋白和未知基因等。与程序性细胞死亡、信号转导和细胞因子相关基因的差异表达可能是甲基乙二醛通过线粒体信号通路,诱导人牙周膜成纤维程序性细胞死亡,破坏牙周组织增生,从而导致牙周病发生的机制。     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.     

人酸性成纤维细胞生长因子突变体表达与修饰

采用聚合酶链式反应(PCR)法将人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)基因中编码第98位和第132位半胱氨酸(Cys)的密码子突变为编码丝氨酸(Ser)的密码子,构建重组质粒pET3c-haFGF Ser98,32,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达率达到23．48％．用MTT法测定产物的活性,发现haFGF Ser98,132突变体的比活与天然haFGF相似．采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)5000-马来酸酰亚胺酯定点修饰第31位Cys,修饰率达到30％以上,修饰产物的比活性保留55．53％．     

hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列；信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子(human soluble B Lymphocyte Stimulator，hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因；融合基因插入pcDNA3、pcDNA3．1、pEFneo质粒；信号肽引物设计时，突变同义密码，最终重组质粒成为分泌表达质粒；磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV-dhfr，共转染CHO-dhfr^-细胞；选择培养液筛选，氨甲喋呤扩增表达，获稳定表达rhsBLyS细胞株；ELISA检测浓缩表达上清，结果表明：rhsBLyS表达量由0．13μg/mL上升至0．55μg/mL。     

TGFβ1shRNA靶向抑制离体胎鼠肺成纤维细胞TGFfβ1基因表达

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对离体胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗提供技术基础和依据.方法:原代培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型.针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1shRNA绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空白组为对照,通过JetPEI包裹分别转染上述高氧损伤的胎鼠肺成纤维细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用实时荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:①成功培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型;②荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TG-Fβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1 mRNA表达量,转染后24、48和72 hTGFβ1shRNA质粒组TGFβ1 mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.3%、96.9%和71.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染胎鼠肺成纤维细胞后24、48和72 h均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子诱导Balb/c3T3细胞增殖的实验研究

目的研究不同浓度重组人碱性成纤维细胞因子对Balb/c 3T3细胞增殖活性的影响.方法重组质粒pGEX-bFGF转入到DH5α大肠杆菌体内,增菌培养表达bFGF,亲和层析纯化,制备8种不同药物浓度的bFGF,分别进行诱导Balb/c 3T3细胞增殖实验研究,MTT法检测各组细胞增殖活性.结果 bFGF诱导Balb/c 3T3细胞增殖存在浓度依赖性,最适浓度为4～16μg/L.结论 bFGF具有较好的诱导Balb/c 3T3细胞增殖的能力,为后续研究工作奠定实验基础.     

重组碱性成纤维细胞生长因子对β-淀粉样蛋白诱导新生大鼠海马神经细胞凋亡的抑制作用

目的：探索不同剂量重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的海马神经细胞凋亡的抑制作用及治疗老年性痴呆(AD)的可能机制。方法：分离培养新生大鼠海马组织神经细胞，用Aβ25-35诱导分化成熟的海马神经细胞凋亡，采用Hoechst33258染色法、Annexin-V法、脱氧核糖核酸琼脂糖凝胶电泳、蛋白质杂交技术研究加入Aβ25-35培养的以及Aβ25-35和bFGF、共培养的海马神经细胞的形态和分子生物学改变及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的变化。结果：Aβ25-35可诱导海马神经细胞核脱氧核糖核酸发生降解，出现胞浆浓缩、凋亡小体形成等；而Aβ25-35和bFGF共培养的海马神经细胞则能缓解这种形态学上的变化，细胞凋亡率减少，Bcl-2的表达量上调而Bax表达量下调。结论：bFGF能抑制Aβ25-35对神经细胞的毒性作用，其机制可能是通过调控Bcl-2、Bax的表达来实现的。     

酸性成纤维细胞生长因子受体及信号转导的研究进展

酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的生物学功能与受体结合、细胞信号转导具有密切的关系。近年来已发现5种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，其中主要是FGFR-1、FGFR-2与aFGF结合并被激活，启动多条信号转导途径，引起胚胎发育、血管生成以及创伤修复等多种生物效应，其中，FGER与aFGF结合后启动的MAPK途径是调节各种细胞趋化应答、分化、分裂的重要途径，是细胞增殖、分化等信息传递途径的交集点和共同通路。     

强力氨肽对小鼠成纤维细胞的影响

蛋白质对细胞合成和代谢有一定程度的影响,高浓度胺肽含有丰富的氨基酸,通过对实验组和对照组小鼠脸颊、腹部和四肢等部位皮下结缔组织的比较,实验组小鼠上述３ 个部位的成纤维细胞数量和直径与对照组相比均有显著差异,而且细胞外基质成分也比对照组发达实验证明强力氨肽具有促进成纤维细胞的分裂和合成能力,对伤口愈合增强皮下结缔组织的韧性和弹性具有显著作用     

矽肺肺泡巨噬细胞溶菌酶的促成纤维细胞增殖作用

溶菌酶(MW～14KD)是一种水解细菌细胞壁多糖的水解酶.危害严重的职业病矽肺患者血清溶菌酶显著升高.本文报道,采用高效液相色谱技术,包括凝胶过滤柱层析和反相C-4高效液相色谱柱层析,从实验性矽肺大鼠的肺泡灌洗液(BALF),肺泡巨噬细胞裂解液(AME)及其条件培养液(AMCM)中,分离纯化了一种可诱导的巨噬细胞来源的细胞因子(iSPMF-P 15),其分子量约为15.4KD,它具有较明显的刺激成纤维细胞增殖的作用.因此,矽肺肺泡巨噬细胞来源的溶菌酶可能是矽肺纤维化病变中的一种致纤维化的细胞因子.     

成纤维细胞和纤维肉瘤细胞的中等纤维构型特点及其意义

对体外培养的成纤维细胞，高分化纤维肉瘤细胞、低转移性及高转移性纤维肉瘤细胞的中等纤维的构型进行了研究。结果显示：中等纤维在恶变细胞中，其构型经发生紊乱，并随细胞恶变程度的增加，其紊乱的程度也相应增加。说明中等纤维构型变化紊乱是恶变细胞的异型性表现之一。转移率高的瘤细胞，这种异型性更大。     

小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻保存研究

为了摸索小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的简易方法,采用常规冷冻和玻璃化冷冻2种模式,探讨了不同的冷冻方法、不同的冷冻前平衡时间、不同的冷冻保护液的配比等因素对成纤维细胞冷冻效果的影响。实验结果表明:常规冷冻采用含10%(体积分数)甘油的DMEM液作保护剂,可将0~5℃下平衡时间缩短至45~60 min,细胞活力可达0.87。玻璃化冷冻采用10%(体积分数)NBS+1.8 mol/L乙二醇+0.1 mol/L蔗糖的PBS冷冻小鼠胎儿成纤维细胞效果好于其他组合,细胞活力可达到0.86。玻璃化冷冻法与常规冷冻法的冷冻效果差异不显著。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养。方法取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选。结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖最为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11min为宜。结论通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础。     

融合蛋白GSH-bFGF的构建、表达及体外活性检测

目的:设计构建和表达新型融合蛋白谷胱甘肽-碱性成纤维细胞生长因子(Glutathione-basic fibroblast growth factor,GSH-b FGF),并检测其体外抗氧化、抗衰老能力.方法:采用RT-PCR,酶切,连接,转化等分子克隆技术构建新型融合蛋白GSH-b FGF,并通过镍柱亲和层析、阳离子交换层析纯化该目的蛋白.通过CCK-8试剂盒检测GSH-b FGF对鼠源成纤维细胞NIH-3T3的促增殖活性.同时,经总抗氧化检测试剂盒检测GSH-b FGF的抗氧化能力.结果:克隆表达并纯化获得融合蛋白GSH-b FGF.CCK-8促增殖结果显示质量浓度为20 ng/m L的GSH-b FGF可显著促进鼠源成纤维细胞NIH-3T3增殖.体外抗氧化结果显示GSH-b FGF有显著的抗氧化活性,纯化得到的GSHb FGF蛋白的GSH浓度约为(0.06±0.02)μmol/L,抗氧化能力为(0.56±0.23)mmol/g.结论:新型融合蛋白GSHb FGF有显著的体外促增殖能力及抗氧化活性.     

山羊FGF5基因cDNA分子克隆及序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,首次从山羊脑组织总RNA中扩增出成纤维细胞生长因子5(FGF 5)基因的cDNA编码序列.通过对序列的分析表明,克隆的山羊FGF 5cDNA编码序列与其他动物的序列具有高度的同源性.与G enbank中人和小鼠序列比较,山羊与人和小鼠的FGF 5核苷酸序列的同源性分别为91%和87%.编码的氨基酸序列比较,山羊和人的相似性为87%,山羊与小鼠的相似性为83%.如FGF s家族的其他成员一样,山羊的FGF 5蛋白也有一信号肽序列.山羊FGF 5基因外显子在编码氨基酸时,对同义密码子的使用表现有强烈的偏好性.不同物种对同义密码子使用的偏倚程度与偏好类型各不相同,也具有种属特异性.山羊FGF 5基因所编码的蛋白质中,20种氨基酸的含量差异很大,极性氨基酸含量高于非极性氨基酸含量.     

基因重组碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脊髓损伤神经保护作用

目的 :探索碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对大鼠脊髓损伤的神经保护作用 方法 :将吸入bFGF的胶原蛋白海绵或空白海绵贴敷于大鼠脊髓损伤处 ,术后 1、2、3周 ,对大鼠机能进行评分 ,并对大脑运动皮质进行电镜观察分析 结果 :术后 1、2、3周 ,bFGF组大鼠运动评分均明显优于对照组 (Ρ <0 .0 5) ,运动皮质电镜结果显示bFGF组线粒体、内质网轻度肿胀 ,神经毡结构正常 ,无明显胶质细胞增生 程度较对照组明显减轻 结论 :bFGF对大鼠脊髓受损神经纤维起源脑区—运动皮质的神经细胞具有明显的保护作用 ,进而使大鼠运动功能受损明显减轻     

柞蚕核型多角体病毒fgf基因的克隆和分析

为获得柞蚕NPV的全基因组序列，在柞蚕尸体中分离纯化柞蚕NPV，提取其基因组DNA，分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ基因文库．对插入片段进行测序，经过同源性分析发现一个与人源fgf基因相似的基因，其读码框含有185aa．核苷酸和氨基酸同源性比较的结果表明：在genebank中没有同源性极高的序列，是个新基因；柞蚕NPV的fgf基因与云杉卷叶蛾NPV的同源性较高，分别为56．1％和45．9％，而与家蚕NPV及AcNPV的同源性相对较低，说明柞蚕NPV与家蚕NPV在进化上亲缘关系较远．该基因的克隆为进一步研究其在病毒感染过程中的作用打下基础．