AWRK6改善HepG2细胞胰岛素抵抗的初步研究

实验利用高浓度胰岛素体外诱导HepG2细胞,构建胰岛素抵抗细胞模型,采用葡萄糖氧化酶法和甘油三酯酶法检测模型细胞的葡萄糖消耗量和甘油三酯合成量,在细胞水平上分析AWRK6对HepG2细胞胰岛素敏感性的影响.结果显示HepG2细胞在10μmol/L胰岛素中作用24 h,葡萄糖消耗量显著降低(P0.01),成功诱导出稳定的HepG2细胞胰岛素抵抗模型.AWRK6可显著增加模型细胞葡萄糖的消耗量及甘油三酯合成量(P0.01).研究结果表明AWRK6能增强HepG2细胞的葡萄糖消耗能力,改善HepG2细胞胰岛素抵抗.     

荔枝核有效成分富集物抑制细胞摄取胰岛素的机制

研究并比较了荔枝核(LSE)不同极性的有效成分富集物对HepG2细胞胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)模型糖代谢的作用,并对其机制进行探讨.使用大孔树脂对荔枝核不同极性的有效成分进行富集,分别获得经水和不同体积分数(30%、50%、70%)乙醇洗脱的3种荔枝核提取物(LSE30、LSE50、LSE70),以高浓度胰岛素培养基诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型,通过葡萄糖氧化酶法、四唑盐比色实验(MTT)、实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)和免疫印迹实验(Western blot),检测LSE30、LSE50、LSE70对胰岛素抵抗细胞模型的葡萄糖消耗量、细胞存活率和A腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)能量代谢通路的基因表达和蛋白表达的影响.结果表明:HepG2细胞在1μmol/L胰岛素中作用24 h,葡萄糖消耗量明显减少(P0.01),说明实验成功诱导出稳定人肝癌细胞胰岛素抵抗模型;荔枝核提取物可以阻止因高浓度胰岛素诱导的AMPKα2和p-AMPK水平的降低.因此,荔枝核提取物可以改善HepG2细胞胰岛素抵抗模型的能量代谢和脂代谢,抑制脂肪酸和蛋白质的合成.     

胰岛素抵抗及高血糖对GFAT活性的影响

分别观察了胰岛素抵抗和高血糖水平对己糖胺途径限速酶GFAT活性的影响.在alloxan高血糖小鼠模型中,与正常对照组比较,血清果糖胺水平升高了15.9%,肾组织GFAT活性升高了32.8%;经胰岛素治疗后,血清果糖胺水平降低了9.7%,其肾组织GFAT活性也降低了l9.4%.在高糖高脂饲料诱导的胰岛素抵抗的IR小鼠中,与同批正常对照组比较,正糖钳实验中稳态时葡萄糖输注率G IR值降低了69.3%,胰岛素耐量实验中的AUC值升高了38.1%,其肾脏组织GFAT活性也增加了26.6%.在胰岛素诱导的具有胰岛素抵抗的IR-H IR c细胞模型中,与正常H IR c细胞比较,其10、25 nmol/L胰岛素诱导的葡萄糖摄取能力分别降低了25.3%、21.1%,而GFAT活性分别增加了29.7%、46.5%.可见,GFAT活性与一段时间的平均血糖水平和胰岛素抵抗状态密切正相关.     

新资源食品提取物辅助降血糖配方的确定

以α-葡萄糖苷酶抑制剂体外模型实验筛选出4种具有较强活性的新资源食品提取物原料,进行混料配方优化设计,获得较优配方比例为:青钱柳提取物26.05%,葡萄皮提取物10.00%,桑叶提取物22.13%,枇杷叶提取物41.82%。采用高浓度葡萄糖刺激HepG2细胞体外降血糖评价模型对优化配方进行功能评价,结果显示配方可显著提高胰岛素抵抗模型的葡萄糖利用率,对造成的胰岛素抵抗具有一定的改善作用,且呈现一定的浓度依赖效应。     

卵泡膜细胞的胰岛素抵抗对其雄激素合成的影响以及胰岛素增敏剂的调控机制

为探索卵泡膜细胞人工诱导胰岛素抵抗后其雄激素合成的变化,以及胰岛素增敏剂曲格列酮、二甲双胍对胰岛素抵抗卵泡膜细胞的调控作用,采用猪卵巢内卵泡膜细胞进行体外培养,地塞米松诱导,构建胰岛素抵抗的细胞模型,用曲格列酮和二甲双胍分别处理模型细胞,检测培养液中葡萄糖和激素水平的变化以及胰岛素信号分子和雄激素合成关键酶的mRNA表达变化.结果表明:卵巢内卵泡膜细胞发生胰岛素抵抗后能明显增进其雄激素合成能力:曲格列酮、二甲双胍均能降低胰岛素抵抗的卵泡膜细胞的糖代谢异常和雄激素水平.     

胰岛素增敏剂对卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗的调控作用

以人工诱导卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)细胞模型,观察细胞内关键信号分子的表达以及胰岛素增敏剂的体外作用。通过沃曼青霉素(Wortmannin,WT)特异性地抑制胰岛素传导途径中磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)通路,作用于体外培养的猪卵巢颗粒细胞48h后,再加入曲格列酮、二甲双胍、小檗碱、隐丹参酮48h,观察对IR的改善情况。以葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的消耗量,以蛋白印记法(Western Blot)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光PCR法,检测葡萄糖转运蛋白4(Glut4)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达。结果表明:胰岛素糖代谢途径被WT阻滞,IR细胞对培养基中葡萄糖的摄取明显抑制。二甲双胍、小檗碱和隐丹参酮,都能使葡萄糖摄取增加,但稍逊于曲格列酮。IR细胞的Glut4的表达下降,MAPK和PPAR-γ表达升高;胰岛素增敏剂可以部分逆转IR细胞的上述信号蛋白的表达异常,以曲格列酮作用最为显著。总之,WT阻断PI-3K途径产生IR,胰岛素增敏剂能改善IR,隐丹参酮和小檗碱增敏的作用类似二甲双胍,而曲格列酮作用最为显著。     

DHA对糖脂代谢异常HepG2细胞甘油三酯和胆固醇合成的影响

目的探讨不同剂量的二十二碳六烯酸(DHA)对棕榈酸(PA)培养后的HepG2细胞甘油三酯和胆固醇合成的影响。方法 HepG2细胞分为无血清培养基培养的对照组和含有0.25 mmol/L PA的无血清培养基培养的PA组以及用DHA替代20%、50%、100%PA的DHA替代组。对照组和PA组培养24 h后用无酚红低糖培养基鉴定细胞是否出现胰岛素抵抗,并测定细胞内甘油三酯(TG)、胆固醇(TCH)水平;模型成立后用DHA替代20%、50%、100%PA培养12 h,再次检测细胞葡萄糖摄取量、TG和TCH水平,Western blot检测脂肪酸、胆固醇合成关键基因SREBP-1c和SREBP-2的蛋白表达水平。结果 PA处理后HepG2细胞活性明显下降,葡萄糖摄取量显著低于NC组(P0.05),说明HepG2细胞出现胰岛素抵抗,且PA组TG、TCH水平均有不同程度的升高;用DHA替代PA后,细胞活性有所改善,葡萄糖摄取量较PA组有明显升高(P0.05),TG、TCH水平较PA组均有不同程度的降低,并且SREBP-1c和SREBP-2表达随DHA浓度升高呈下降趋势(P0.05)。结论 DHA可抑制SREBP-1c和SREBP-2的表达,从而抑制TG、TCH的合成,改善细胞脂代谢紊乱及胰岛素抵抗。     

石松属植物化学成分抗炎活性的筛选

为研究2种石松属植物化学成分的抗炎活性,筛选具有较强抗炎活性的化合物,用LPS诱导RAW264.7细胞建立了体外炎症模型,采用MTT法检测了化合物对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞增殖的影响.在安全浓度范围内(细胞存活率大于80%)给予药物干预,用Griess法检测了培养上清液中一氧化氮(NO)水平,以各化合物抑制NO释放的能力为筛选指标,评价了化合物的抗炎活性.结果表明:乙酰基二氢石松生物碱(16)、对香豆酸甲酯(21)、豆甾烷-3-酮-21-酸(22)具有较好的NO抑制率,并呈一定剂量依赖关系,提示它们具有一定的抗炎活性.     

地塞米松和胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机理

用地塞米松和胰岛素长期作用3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，用胰岛素增敏剂罗格列酮改善胰岛素抵抗，微量化GOD=POD法检测培养基中残存的葡萄糖，并检测细胞中葡萄糖转运子G1ut4基因和蛋白及胰岛素信号传递元件IRS—1的基因变化．探讨了地塞米松和胰岛素诱导3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗的机理．结果发现：①地塞米松和胰岛素诱导3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，细胞对葡萄糖的摄取减少．罗格列酮改善抵抗后，葡萄糖的摄取较抵抗组增加．②抵抗时，葡萄糖转运子G1ut4基因和蛋白水平明显降低，改善后基因表达上调显著，蛋白水平升高，介于正常对照组与抵抗组之间．②IRS-1在抵抗时下调，用罗格列酮改善后，IRS—1的基因水平无明显变化．     

雌酚酮-17-杂环取代衍生物的合成及抗肿瘤活性评价

以雌酚酮为原料,合成了7个雌酚酮-17-杂环取代衍生物,经过核磁共振~1H NMR、~(13)C NMR、质谱MS和红外光谱IR确定了目标化合物的化学结构。选用人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)和人肺癌细胞(A549)对化合物进行抗增殖活性评价。结果表明,雌酚酮-17-(5-氯-吲哚)腙(3f)对Hep G2细胞和Hela细胞具有显著抑制活性,其半数抑制浓度(IC_(50))分别为13. 60μmol/L和8. 74μmol/L。     

8-烷基小檗碱同系物体外降糖作用

为研究8-烷基小檗碱同系物在体外对糖代谢的影响,采用与人肝细胞表型相似的HepG2细胞,检测24 h后培养液中葡萄糖消耗量,用MTT法监测细胞增殖的情况.结果表明:8-烷基小檗碱同系物在中糖(11.1mmol/L)状态下可使HepG2细胞的葡萄糖消耗量有不同程度的增加,其中以8-十六烷基小檗碱最为显著.MTT结果显示8-烷基小檗碱同系物对HepG2细胞的增殖有显著的抑制作用.8-烷基小檗碱同系物随着其烷基碳链的延长,其降糖效果越来越明显.     

红树无瓣海桑果实中抗氧化活性成分研究

从红树无瓣海桑果实中分离出6个化合物,运用波谱学确定了化合物结构,分别鉴定为异鼠李素（1）,胡萝卜苷（2）,木栓酮（3）,熊果酸（4）,3,4-二羟基苯甲酸（5）,对-羟基-3-甲氧基苯甲酸（6）.化合物（1）,（3）,（4）对HepG2显示出抗氧化活性,其EC50值分别为（25.8士1.3）mM,（62.1±3.5）mM,（45.2±2.8）mM.化合物（1）～（6）均首次从该植物果实中分离得到.     

美洲大蠊多肽和顺铂联用对HepG2细胞凋亡及自噬的影响

采用MTT法检测美洲大蠊多肽（PAP-3）与不同浓度的顺铂（DDP）单用或联合使用对人肝癌HepG2细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测PAP-3、DDP单独或联合给药干预对HepG2细胞凋亡的影响；Western Blot检测PAP-3、DDP单独或联合给药后HepG2细胞内自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1、Atg5及PI3K的表达。实验结果显示，与DDP单独给药相比，PAP-3与DDP联合给药对HepG2的细胞的抑制作用更强；PAP-3与DDP联合给药组中细胞的凋亡率与DDP和PAP-3单独给药组相比均有升高（P ＜ 0.05)。与对照组相比，DDP组中，p62蛋白水平降低，LC3II蛋白水平升高，LC3II/I的比例也升高，表现出细胞自噬流的活化；与DDP组相比，联合给药组中p62蛋白水平回升，LC3II蛋白水平和LC3II/I的比例均有回落。且联合给药组中PI3K、Atg5、Beclin-1等自噬相关蛋白的量均较DDP组减少，而凋亡相关的Caspase-3蛋白的表达量则较DDP组增加。据此推测，PAP-3和DDP的联用可以通过抑制HepG2细胞自噬相关蛋白的表达水平，抑制DDP带来的细胞自噬水平的升高，增加细胞对DDP的敏感性，从而诱导HepG2细胞凋亡。     

藏木香石油醚快速溶剂萃取物体外抑制肝癌细胞增殖活性研究

为充分开发利用藏药资源,对藏木香进行体外抗肝癌活性评价,并对活性部位的细胞毒活性及初步抗肝癌机制进行研究.运用快速溶剂萃取法制备藏木香的各溶剂提取物,采用MTT法、细胞形态学观察、Hoechst 33258荧光染色、流式细胞术和蛋白免疫印迹等分析藏木香各提取物抗肝癌活性及活性部位抗肝癌机制.藏木香石油醚提取物(IR-Pe)对HepG2和Hep3B都有良好的抗肝癌活性,其IC50值分别为21.9 ± 2.3 μg·mL－1、27.6 ± 2.5 μg·mL－1,且对正常肝细胞L-02在100 μg·mL－1未显示出毒性.IR-Pe对HepG2和Hep3B两个肝癌细胞株皆显示出显著的时效和量效关系;细胞形态学观察及流式细胞术显示IR-Pe明显的诱导肝癌细胞凋亡.IR-Pe明显地上调Bax和切割后的caspase-3蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达.IR-Pe具有良好的体外抗肝癌活性,其通过调控线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡发挥抗肝癌活性,具有极大的开发应用潜力.     

佛甲草中细胞毒活性成分的研究

采用中压柱色谱和制备高效液相色谱法对中国传统民族药佛甲草(Sedum lineare Thunb)的甲醇提取物化学成分进行分离,从中分离得到6个化合物.首次对化合物山奈酚7-O-6″-O-丙二酸单酰-D-吡喃葡萄糖苷(1)的波谱数据进行了归属,用MTT法测试6个单体成分对人肝癌细胞株HepG2和Hep3B的抑制作用.结果显示6个化合物均对HepG2和Hep3B细胞表现出抗肿瘤活性,并且IC50值在22.6～91.5 μg/mL之间,在浓度大于100 μg/mL时也没有表现出对人正常肝细胞L－02的抑制作用.相比于黄酮类化合物1、2,苯丙酸类化合物3～6(IC50＝22.6～44.3 μg/mL)对HepG2和Hep3B细胞表现出更强的抑制作用.其中,顺式苯丙酸类化合物5对HepG2和Hep3B细胞的抑制作用最明显.其IC50值范围在22.6～28.2 μg/mL,能明显抑制人肝癌细胞的增殖,诱导其凋亡.     

酿酒酵母呼吸突变株的高糖胁迫反应研究

【目的】研究野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002及其糖分利用能力显著提高的呼吸突变菌株MF15c在高糖胁迫下的生理特性变化。【方法】测定在高糖胁迫下菌株的生长速率、出芽率、乙醇产量和超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力。【结果】在葡萄糖浓度分别为25%、30%和40%的高糖培养基中,MF15c菌株生长和乙醇发酵受抑制的程度均明显低于MF1002。当葡萄糖浓度为30%和40%时,MF15c的最大菌体数目、最高出芽率和乙醇发酵浓度等均显著高于MF1002。当葡萄糖浓度为30%时,两菌株胞内的SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力均显著上升。其中,MF15c的胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力在高糖胁迫下的上升幅度显著高于MF1002。【结论】MF15c较MF1002具有更强的高糖耐受能力。SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶均参与了两菌株的高糖胁迫反应,胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力可能与MF15c菌株的高糖耐受能力有关,可作为进一步改造该菌株的指导指标。     

In vitro assay of cytoskeleton nanomechanics as a tool for screening potential anticancer effects of natural plant extract, tubeimoside I on human hepatoma (HepG2) cells

Cytoskeleton nanomechanics characterizes cancer cell’s physical behaviors such as how it spread and invade. For anticancer drug, cytoskeleton nanomechanics may be a target to inhibit invasiveness and metastasis of cancer cells. Therefore, in vitro assay of cytoskeleton nanomechanics may be used to evaluate the effects of potential anticancer drug on various cancer types. Here, we investigated the effects of tubeimoside I (TBMS I) on human hepatoma (HepG2) cells by using optical magnetic twisting cytometry, a well-established technique for measuring nanomechanics of the Factin cytoskeleton. TBMS I is a natural compound extracted from a traditional Chinese herbal medicine, and is reported with antitumor effect. In this study, we demonstrated that the cytoskeleton stiffness (G) of HepG2 cells was affected by TBMS I. G′ exhibited a typical power law with respect to the loading frequency (f), i.e. G~f . The magnitude of G′ and the value of exponent (α) of the HepG2 cells decreased consistently with the increase of concentration for TBMS I exposure. In addition, the HepG2 cells responded to TBMS I much faster than the normal liver (L-02) cells. Such alteration of cytoskeleton nanomechanics induced by TBMS I was reported for the first time, which was further corroborated by assays of Factin cytoskeleton structure and cell migration. Taken together, these results suggest that in vitro assay of cytoskeleton nanomechanics may have a great potential as an additional tool in screening of anticancer drug candidates.     

KLF4沉默与阿霉素诱导的DNA损伤协同抑制肝癌HepG2细胞的生长

探究KLF4沉默与经不同作用浓度阿霉素处理诱导的DNA损伤对肝癌HepG2细胞增殖凋亡的影响及其作用机制.应用RNA干扰技术,采用siRNA转染HepG2细胞以沉默KLF4基因.采用MTT法检测KLF4沉默前后对HepG2细胞增殖的影响,使用流式细胞术检测KLF4沉默前后对HepG2细胞周期变化影响,应用Western blot法检测转染前后HepG2细胞中KLF4蛋白及细胞周期相关蛋白表达变化.Western blot检测到高浓度的阿霉素促进KLF4的表达,并且低浓度的阿霉素可使得细胞停滞在G2/M期,高浓度的阿霉素则使部分细胞凋亡(19.31%).将KLF4沉默后,发现细胞生长变缓,低浓度的阿霉素处理后,细胞随时间增加而出现更多的细胞凋亡;高浓度的阿霉素处理后,细胞数明显减少,更多的细胞发生凋亡(28.89%),且在KLF4沉默前后均发现低浓度阿霉素促进p53与p21表达,高浓度阿霉素抑制其表达.阿霉素诱导的DNA损伤可提高KLF4的表达,KLF4依赖于DNA损伤激活的p53促进p21的表达,进而引起G1/S期细胞周期阻滞.沉默KLF4与阿霉素诱导的DNA损伤可协同抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡,其在肝癌细胞 HepG2中扮演十分重要的角色.     

赤参水提物对人肝癌细胞株HepG2细胞的影响

探讨了赤参水提物对人肝癌细胞株HepG2细胞的影响.采用体外培养的人肝癌细胞HepG2细胞株,接种入96孔板,24 h后加入赤参水提物,MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)法,计算肝癌细胞生长存活率;Acridine orange/ethylene dibromide(AO/EB)荧光染色法,检测细胞形态学变化;RT-PCR法检测细胞Bcl-2、Bax、p53基因表达变化.结果表明,赤参水提物可剂量-时间依赖性地抑制HepG2细胞增殖;1.0 mg/mL赤参水提物处理HepG2细胞24 h后,细胞荧光染色出现了明显的凋亡细胞;赤参水提物处理HepG2细胞后,Bcl-2 mRNA表达量剂量依赖性地减少,而Bax和p53 mRNA表达量剂量依赖性地增加.     

邻菲罗啉衍生物与人端粒G-四链体DNA的相互作用及细胞活性研究

通过紫外可见吸收滴定,荧光滴定和聚合酶链反应停止分析(PCR stop assay)方法研究了3个邻菲罗啉衍生物1-3与人端粒G-四链体DNA在包含100mmol·L-1 KCl的磷酸缓冲体系中的相互作用,并用MTT法研究了化合物对人肝癌细胞HepG2增殖的影响.结果表明:这三个化合物都能与G-四链体相互作用并显著稳定其结构,结合常数约为1×106 mol-1·L;同时这些化合物能在微摩尔浓度抑制HepG2细胞增殖.