有机磷水解酶全细胞生物催化剂的特性

利用有机磷水解酶大肠杆菌细胞表面展示工程菌为全细胞催化剂,研究了其降解对氧磷的反应.确定了最适反应条件为:反应温度37 ℃、pH值8.0、底物浓度2.0 mmol/L、振荡速率120 r/min,在此条件下反应5 h,对氧磷降解率可达80%左右,且全细胞催化剂具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景.     

Burkholderia cepacia XYU-6脂肪酶的克隆及其细胞表面展示

通过分析GenBank中Burkholderia cepacia脂肪酶的序列,设计简并引物,采用同源克隆的策略,成功地从B. cepacia XYU-6菌株中克隆到脂肪酶基因bcl,其大小为1095 bp,编码364个氨基酸（ GenBank登陆号KR233260）.将bcl基因与质粒pET-28b（＋）连接并转化大肠杆菌,使脂肪酶BCL的大肠杆菌胞内过表达,其活力是野生菌的12.9倍.通过将bcl基因克隆到细胞表面展示载体pZXL中,构建脂肪酶BCL的细胞表面展示工程菌,使BCL在Lpp-OmpA引导下定位于大肠杆菌细胞表面,其活力是野生菌的3.9倍.研究结果为脂肪酶BCL后续的分子改造和应用奠定基础.     

纤维素酶在酿酒酵母中的表面展示

利用木质纤维素进行生物法生产燃料乙醇在解决世界能源危机上有十分广阔的前景,但该产业受到预处理的限制,因此以酿酒酵母表面展示技术为依托,构建纤维素酶全细胞酶,既能水解木质纤维素又能利用水解木质纤维素得到的糖类发酵生产乙醇.将编码絮凝素锚定蛋白基因flo1与纤维酶基因cbh2串联整合在同一个开放阅读框中并构建p HBM368-PGK-flo1-cbh2重组表达载体.线性化重组表达载体后再导入尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSc细胞,经由功能筛选及流式细胞法验证纤维素酶成功地展示表达在酿酒细胞表面.通过DNS法测得该全细胞酶在50℃反应1 h酶活为66. 75 U/mL.成功构建了以酿酒酵母为宿主菌的全细胞酶,为后期全细胞酶协同降解秸秆等系列研究奠定基础.     

大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌噬菌体结合肽

构建重组表达载体,将分枝杆菌噬菌体中分离出小分子肽段PK34的基因与大肠杆菌外膜蛋白OmpC基因相融合,并利用OmpC自身启动子将PK34及组氨酸标签在大肠杆菌外膜上进行重组蛋白表达,借助磁珠建立表面展示体系.结果表明,利用外膜蛋白OmpC的穿膜特性,能够在大肠杆菌表面对分枝杆菌噬菌体PK34肽段进行展示.通过表面展示...     

植酸酶在酿酒酵母细胞表面上的展示及其活性测定

提取黑曲霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR扩增出约1.4kb的植酸酶基因,双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1,转化大肠杆菌DH5α,提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100,诱导表达后每隔12h测定植酸酶酶活,结果测得最佳诱导时间为48h.通过对表达产物的酶学性质研究,发现该表达产物在pH7.0时具有较高植酸酶活性,同时该表达产物的最适温度约为65℃.     

大肠杆菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表达、纯化及晶体学研究

采用分子克隆方法将来源于大肠杆菌O157的mpaA基因构建入pET-21b(+)表达载体.诱导MpaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,通过Ni亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步法纯化得到高纯度蛋白.使用气象扩散法进行蛋白质晶体生长的初步筛选与优化,得到MpaA蛋白质单晶,并使用X射线衍射仪进行衍射数据的收集与处理.MpaA晶体分辨率为0.26 nm,属于P31空间群,晶胞参数为a=5.989 3 nm,b=5.989 3 nm,c=12.987 0 nm,β=90.000 °.MpaA晶体衍射数据的收集为后续结构解析和催化机制的阐明提供了基础.     

接种密度对Vero细胞在微载体表面生长的影响

研究了接种密度对Ｖｅｒｏ细胞在微载体表面生长行为的影响,发现培养过程中所获得的细胞最高密度随接种密度的增加而有所提高,当细胞的表面接种密度高于１．０×１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍｇＭＣ时,因贴壁后细胞扩展受到限制而不利于进入对数生长期。就整个Ｖｅｒｏ细胞培养过程,适宜的表面接种密度为３×１０＾－４－７×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｍｇＭＣ,此时可以获得较高的比生长速率和细胞增殖倍数。     

多肽的表面展示与结构库

表面展示是一种新的基因操作技术,它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用,并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。常用丝状噬菌体、T₄噬菌体、λ噬菌体以及细胞构建表面展示系统。表面展示库包括重组噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制,以及生物分子实验定向进化等研究。     

植物乳杆菌LAI的酵母表面展示

为了研究亚油酸异构酶(LAI)的功能并构建基因工程菌株,克隆了植物乳杆菌1p15-2-1的lai基因并对其编码序列进行分析比对,随后将其融合酵母信号肽序列和0-凝集素锚定序列,构建酵母表面展示载体;使用电击法转化酿酒酵母K601,并在尿嘧啶缺失型培养基上筛选出转化子.氨基酸序列比对分析表明,LAI与肌球蛋白交叉反应抗原...     

环亚酰胺水解酶在大肠杆菌中的重组表达与纯化

以重组质粒pEI为模板,PCR扩增环亚酰胺酶基因序列,插入pMAL-s表达载体中.重组质粒转入E.Coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导可溶性表达融合蛋白MBP-CIH,利用Amylose亲和柱一步纯化获得MBP-CIH,再经人鼻病毒3C蛋白酶切除亲和臂MBP,硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析获得电泳纯的CIH,纯化倍数为12.7,活力回收29%,比活为36.3 U/mg.重组环亚酰胺水解酶的最适pH为8.0～9.0,最适温度50 ℃,在温度低于55 ℃时酶的性质相对稳定.Ni2 、Co2 能显著提高酶活力,Mn2 、Ca2 和Mg2 对酶活没明显有影响,Cu2 、Zn2 、Cd2 、Fe2 以及金属螯合剂8-羟基喹啉、EDTA则对酶有不同程度的抑制作用.初步说明该酶是一个金属依赖性酶.     

广谱降解有机磷农药的真菌酶解研究

从农药污染土壤中分离出的一株真菌具有广谱降解有机磷农药的能力.菌体培养物经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sephrose CL6B柱层析纯化广谱有机磷农药水解酶.研究结果表明该酶为胞内酶,主要定位在细胞膜上.酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.5,在50℃以下以及在pH6～9.5范围内活性稳定.Hg2 、Fe3 、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu2 、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用.该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药.以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为63μmol/L,256μmol/L;Vmax分别为306μmol·min-1,189 μmol·min-1;Kcat分别为1 102 s-1,610 s-1.     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

Antibodies from Escherichia coli

Use of Escherichia coli as an expression host has opened up new possibilities in antibody research and its applications. It greatly facilitates rational engineering and random mutagenesis.     

大肠杆菌基因组的组构

以１９９３年４月为止的ＤＮＡ序列资料为依据，讨论了一年来大肠杆菌基因的研究进展，并以日本和美国科学家分别完成的两大片段的序列资料为中心，评述了大肠杆菌基因组的组成特点及其生物学意义．