高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。     

小鼠H-2D~b-BSP融合基因的构建与表达

目的:构建小鼠H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌中表达.方法:采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠淋巴细胞中扩增出H-2Db链的胞外段基因,经双酶切置换已构建的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使H-2Db与BirA酶底物肽(BSP)序列融合,构建H-2Db-BSP融合基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导融合蛋白表达.结果:构建的H-2Db-BSP融合基因插入正确且序列与GenBank一致;经1mmol/L浓度的IPTG诱导后4h蛋白表达达到高峰,且融合蛋白以包涵体形式存在.结论:成功构建H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步构建H-2Db四聚体,研究T细胞应答提供了物质基础.     

负载SIV抗原肽的中国恒河猴Mamu-B~* 1703可溶性单体及其四聚体的制备和鉴定

目的:制备负载SIV抗原肽的中国恒河猴Mamu-B*1703可溶性单体及其四聚体.方法:以含Mama-B*1703重链cDNA序列的pMD19-T克隆为模板,通过PCR的方法克隆Mama-B*1703重链基因,进而构建羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BSP)的Mamu-B*1703重链胞外域融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.β微球蛋白、SIV抗原肽共存时,通过稀释法复性可溶性Mamu-B*1703单体,经生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4:1的比例混合形成四聚体.结果:ELISA检测显示获得具有正确构象的负载SIV抗原肽的Mamu-B-1703四聚体.结论:印度恒河猴Mamu.B}1701特异性抗原肽IW9,与中国恒河猴的Mamu-B*1703相结合形成可溶性Mamu-B*1703/IW9单体和四聚体.     

编码ATR的胞外区基因cDNA的克隆、测序及表达

目的克隆并在大肠杆菌中表达编码炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,简称ATR)的胞外区基因。方法收集CHO-K1细胞,提取其总RNA,经反转录成单链cDNA,以此为模板PCR扩增出编码ATR胞外区基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后,亚克隆入表达载体pMal-c2x中进行表达。结果利用所设计的引物扩增出完整的编码ATR胞外区基因。以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的39%。结论获得了编码ATR胞外区基因cDNA及其原核表达产物,为进一步研究炭疽毒素致病机理和炭疽病的防治奠定了基础。     

构建的FIt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FIt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:依据FIt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆FIt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定.结果:克隆到FIt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的FIt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的FIt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应.结论:成功克隆FIt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.     

构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的：构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体（Fms—like tyrosine kinase 3 ligand,Fh3L）胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：依据Fh3L基因序列设计引物,以RT—PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Fh3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果：克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21（ED3）中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量（Mr）为19000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论：成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

大肠杆菌系列融合表达载体的构建

许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子(IF2-I)、氮源利用物质A(NusA)和谷胱甘肽转移酶(GST)以及3种伴侣蛋白(GroEL、DnaK和TF)分别克隆至pET30a(+),构建了系列融合表达载体.这些载体含有相同的克隆位点以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因hRnBP克隆到mMBP融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,TEV酶切获得了预期的带型.全细胞偶联生成N-乙酰-D-神经氨酸实验发现mMBP-hRnBP的摩尔转化率较无mMBP标签的体系提高了近60%,证明了融合表达载体中融合标签的适用性.新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择.     

表达肿瘤抗原HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性宫颈癌细胞模型的构建和鉴定

为建立内源性表达58型人乳头瘤病毒(Huamn papillomavirus type 58,HPV-58)重要癌抗原E7蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型.以HPV-58全基因组为模板,采用PCR法扩增E7蛋白的编码基因,构建真核表达载体pEGFP-N2-HPV58E7;转化大肠杆菌DH5α,通过DNA测序鉴定质粒载体;经除内毒素纯化后,将大量制备的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用RT-PCR和细胞免疫荧光方法研究重组质粒在人源细胞中的表达情况;最后,选择HPV检出阴性的HLA-A*0201阳性人宫颈癌C33A细胞株为宿主细胞,采用脂质体转染、G418抗性加压筛选和细胞克隆化培养技术,建立能够稳定表达HPV-58 E7的恒定转染细胞株.采用RT-PCR、Western-blot和细胞增殖测定等方法从转录、翻译和表型等3个层次对所建细胞株进行鉴定研究.研究结果显示:克隆制备了HPV-58 E7蛋白的编码基因;构建获得了能够在人源细胞中表达HPV58E7-EGFP融合蛋白的真核表达质粒;并成功建立了能够稳定表达HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型;核酸和蛋白水平的鉴定结果表明所建模型细胞能够表达HPV-58 E7癌抗原,宿主细胞本身表达的Ⅰ类组织相容性抗原HLA-A*0201有望通过内源性抗原加工途径将E7抗原的细胞毒性T细胞(Cytotoxic lyphocyte,CTL)表位提呈到细胞表面;另外,细胞增殖试验结果亦表明该细胞模型体现出E7蛋白显著的诱导细胞增殖的生物学特征.总之,能够稳定表达HPV-58 E7癌蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型的建立为后续即将展开的以HPV-58 E7为靶标的宫颈癌治疗性疫苗和药物的寻找和研究奠定基础.     

人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定.方法:以RT-PCR方法扩增编码IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白.结果:重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17 400,与IL-7理论分子质量一致;免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明在原核表达的外源蛋白是rhIL-7.rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为:温度为37 ℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4 h.结论:成功的构建了rhIL-7的原核表达载体.     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

人RANKL胞外结构域原核表达载体的构建及表达条件优化

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体核因子κB受体活化因子(RANK)构建的信号通路参与乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。人RANKL胞外结构域基因片段与原核表达载体pET-21b融合并转化至表达菌Rosetta,并对其表达条件进行了优化。通过对诱导时机,诱导温度,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间及甘油浓度的条件优化表明,当IPTG的浓度为0.2 mmol/mL,20℃振荡诱导培养6 h时,甘油浓度为4%时,可在上清中获得高效表达的pET-21bRANKL融合蛋白,为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了良好的基础。     

降钙素基因相关肽衍生物的制备及降血压功能研究

用PCR法将人的降钙素基因相关肽(calcitonin gene related—peptide,CGRP)基因克隆到表达载体pGEX-4T-2的GST基因后,构建成一个新的表达质粒pGEX—CGRP．另外分别将2个有降压功能的小肽HHL和RPLKPW的基因克隆到CGRP基因后,构建成2个表达质粒pGEX—CGRP-3AA和pGEX—CGRP-6AA．将此3个表达质粒转化到大肠杆菌TG1中,获得3个高表达的融合蛋白：GST—CGRP,GST—CGRP—HHL,GST—CGRP—RPLKPW;通过G1utathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白,测定蛋白浓度,利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)来检测蛋白的降血压功能,发现融合蛋白GST—CGRP—HHL具有显著的降压效果,能使舒张压下降8．0kPa,且降压维持时间延长,达到70min以上．     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建

胰岛素样生长因子结合蛋白7（简称IGFBP7）广泛存在于多种正常的组织中，但在相应的肿瘤细胞中的含量极微。试验表明，它在肿瘤发生的不同阶段抑制其生长。采用RT－PCR和Nest-PCR方法，从正常的小鼠脾脏中扩增得到IGFBP7 cDNA片段，测序正确后，克隆于融合表达载体pRSETC中构建原核表达重组体。     

水稻白叶枯病菌luxR同源基因的克隆和表达

luxR基因是革兰氏阴性菌感应反应（Quorum Sensing,QS）LuxR／Luxl环路中起重要作用的基因．从水稻白叶枯病菌中分离到一个luxR同源基因,命名为xooR．xooR全长765bp,编码一个由254个氨基酸残基组成的转录因子,分子质量和等电点分别为28．3ku和8．72．XooR蛋白的N一端15AA-171AA是一个Autoindbind结构域,C-端191AA-245AA是一个HTH（helix-turn-helix）结合DNA结构域利用原核表达载体pET-24a（＋）和gfp基因构建融合蛋白表达系统,Western blot分析表明XooR-GFP融合蛋白大小为54ku,xooR基因成功地在E．coliB1．21中实现了表达．