细菌XSJS3对松材线虫杀线活性的测定

细菌XSJS3是一种新发现的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的细菌,试验比较了细菌XSJS3培养液、细菌培养液滤液及含菌体水溶液对松材线虫的杀线活性,结果发现细菌菌体本身对松材线虫无杀线活性,杀线活性物质存在于细菌的培养液滤液中。通过对该细菌培养液滤液对松材线虫致死过程的观察发现:松材线虫接触该细菌培养液滤液30min后就表现为行动迟缓;在5h后所有虫体均不活动,针刺无反应;24h后部分僵直虫体出现局部膨大,且膨大部位出现体液外渗而虫体最终被消解。对不同培养时间的细菌XSJS3滤液杀线活性的比较试验表明:该细菌分泌的杀线物质在10d内随培养时间的延长而含量增加,杀线活性逐渐提高,不同培养时间下滤液的杀线活性差异明显;但培养15d后,稀释10倍的滤液对松材线虫杀线活性比培养10d时同样滤液的杀线活性则略有下降,但差异不明显,因此获得该细菌分泌的杀线物质较理想的培养时间为10d。将细菌XSJS3培养液滤液进行不同温度的热处理后测定对松材线虫的杀线活性,结果表明引起松材线虫死亡和消解的物质是两个不同物质,存在于培养液滤液中的对松材线虫有杀线活性的物质是热稳定的,而引起松材线虫虫体消解的物质是热不稳定的。     

松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

为了筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,从马尾松林中分离获得了230株细菌,并从中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌,其中JK-JS3菌株对松材线虫的杀线活性最高.将该细菌培养滤液分别稀释2倍、4倍、10倍处理松材线虫,72h后线虫的死亡率均达到100%;线虫死亡后虫体消解,消解率分别为100%、97.8%、96.4%.测定了该细菌培养滤液对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)等植物线虫的杀线活性,结果表明对不同种的线虫杀线活性有差异.该菌株培养滤液对松材线虫和小杆线虫(Rhabditis sp.)的杀线活性最高,其余杀线活性从高到低依次为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、腐生线虫(Panagrellus redivivus)、香蕉穿孔线虫和水稻干尖线虫.形态特征和革兰氏染色观察,该细菌为革兰氏阳性菌、产芽孢、具有周生鞭毛;经Biolog细菌鉴定仪进一步鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

细菌JK JS3对松树线虫的杀线活性及菌种的分子鉴定

分离自马尾松的细菌JK JS3是对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,为了解该菌株对松树体内其他植物线虫的杀线活性并验证经形态学和Biolog方法得到的菌种鉴定结果,笔者测定了该细菌培养滤液对大核滑刃线虫(Aphelenchoides macronucleatus)等7种松树体内植物线虫的杀线活性,并对该菌株的16SrDNA基因进行了扩增测序和比对分析。结果表明：该菌株培养液原滤液对测试线虫24h的杀线率均达到了100%,说明该细菌的杀线谱较广,但培养滤液的不同倍数稀释液对不同种线虫的杀线活性有显著差异,10倍稀释液对霍夫曼尼伞滑刃线虫(B.hofmanni)的杀线活性最高,杀死率为96.9%;其次对李氏长尾线虫(Seinura lii),杀死率为73.7%;再次对松材线虫和拟松材线虫(B.mucronatus),杀死率分别为48.7%和39.0%。而对大核滑刃线虫、吴氏长尾线虫(S.wuae)和外滑刃科线虫(Ektaphelenchidae sp.)的杀死率较低,分别为15%、1.5%和0;该菌株的16SrDNA基因序列BLAST比对结果表明,该菌株与菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42最为接近,相似性为99.86%,处于系统发育树的同一分支,进一步验证了其形态学和Biolog细菌鉴定仪的鉴定结果,确定该菌株的分类地位为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫产卵和繁殖的影响

【目的】 已有研究表明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NJSZ-13菌株对于马尾松具有促生作用,且菌悬液的促生效果最佳。为了进一步解析和评价该菌对松材线虫的生防机理,在虫液和卵液中加入NJSZ-13菌株,研究该菌株对松材线虫的杀线效果以及对其产卵、卵孵化和繁殖量的影响。【方法】 首先通过离心将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株分成菌悬液、发酵液和发酵滤液,并调配成原液、5、10、100和1 000倍的稀释液,其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×10⁸ cfu/mL,以无菌水和NB培养基为对照。①用浸渍法测定NJSZ-13菌株在24 h和48 h对松材线虫的杀线效果。②挑取10对生长良好的雌雄4龄幼虫于1.5 mL离心管,用NJSZ-13菌株处理24 h后将虫卵从离心管冲洗到35 mm培养皿中,统计各处理的产卵量。③在35 mm小皿中加入1 mL无菌卵液(约含400个卵)和NJSZ-13菌株,统计12、24和36 h的孵化虫数。④将100 μL线虫液(含500条松材线虫)与100 μL NJSZ-13菌株混合接入60 mm培养皿的灰葡萄孢中,在25 ℃培养箱培养5 d,用贝尔曼法分离线虫并计数。【结果】 ①NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液原液处理24 h后的杀线率即高达100%,而其菌悬液原液处理48 h后的杀线率仅为81.47%。②NJSZ-13菌株原液能极显著地抑制松材线虫产卵,随着稀释倍数的增大,这种抑制作用逐渐减小。③NJSZ-13菌株的10倍稀释液处理松材线虫卵,在12 h时极显著地抑制卵的孵化,在24 h时仍达到显著水平,在36 h时仅发酵液和发酵滤液有显著的抑制作用。100倍稀释液处理12 h时,发酵液和发酵滤液相对于对照有显著差异,其他处理时间点均无显著差异。④NJSZ-13菌株原液和5倍稀释液处理松材线虫,其繁殖力与对照组有显著差异(P<0.05)。10倍稀释液处理松材线虫时,菌悬液对线虫繁殖力无明显的影响,而发酵液和发酵滤液与对照有显著差异。【结论】 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液、发酵滤液均对松材线虫有杀线作用。其中,发酵液和发酵滤液的杀线效果更显著;NJSZ-13菌株能抑制松材线虫的产卵、卵孵化和繁殖,同样发酵液和发酵滤液的抑制效果较菌悬液明显。     

总状共头霉产生杀线虫活性物质的条件和产物性质的初步研究

研究了培养基组分和培养条件对Sr．菌产生杀线虫活性物质的影响，并经过发酵放大表明，该菌代谢产物具有很强的杀线虫活性。该菌的最适培养基配方为lL土豆汁(200g／L)中加入20g蔗糖，pH自然。最佳培养条件采用500mL三角瓶装量100mL，接种量2％，170r／min，26℃，培养4d，将发酵滤液稀释为原浓度的1／2，其杀线率达到80％；在5L发酵罐上进行放大试验，发酵(44—52)h，将发酵滤液稀释为原浓度的1／2，其杀线率稳定在95％以上。该活性代谢物热稳定性强，呈水溶性，经分离证实活性组分中包含有机酸类物质。     

喜旱莲子草与乌蔹莓等植物提取物对松材线虫的毒杀活性研究

【目的】松材线虫病是当前我国林业生产上危害最严重的森林病害。尽管投入了大量的人力、物力和财力,但松材线虫病防控形势依然严峻。化学杀线剂具有环境局限性,研发高效植物源杀灭松材线虫的药剂对控制松材线虫病疫情,同时降低环境化学污染具有重要意义。【方法】采用乙醇浸渍提取法制备喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides)、乌蔹莓(Cayratia japonica)、迷迭香(Rosmarinus officinalis)等30种植物的提取物,测定其对松材线虫的毒杀活性。利用液液萃取法,用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水等有机溶剂对两种植物中的活性成分进行分步提取,得到药液的质量浓度梯度为10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 g/L,并分别测定其对松材线虫的毒杀活性。虫卵悬浮液在25 ℃恒温保湿培养箱内培养,24 h后开始观察,32 h后结束观察。通过镜检统计线虫卵数,并计算相应的线虫卵累计孵化率和孵化抑制率。【结果】采用质量浓度为10 g/L的喜旱莲子草、乌蔹莓乙醇提取物分别处理松材线虫,72 h后线虫校正死亡率均为 100%。喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓的水层萃取物中存在主要的杀线活性物质,两种植物萃取物处理松材线虫72 h后的半致死剂量(LC₅₀)分别为0.588 8和0.969 3 g/L。在离体虫卵孵化试验中,喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物对线虫的卵孵化抑制率最大,为79.77%,其次为乌蔹莓的水层萃取物,为46.51%。【结论】可见,喜旱莲子草和乌蔹莓对松材线虫成虫和虫卵均具有较强的生物毒杀活性,可作为新型植物杀线虫剂加以开发利用。     

土壤真菌培养物对松材线虫生长和繁殖抑制作用的研究

从土壤分离的９９株真菌以ＰＳＭ培养基培养，检测其培养物对松材线虫生长和繁殖的抑制作用，结果发现１８号菌株显示了极强的抗线虫活性，经初步分析其活性成分为水溶性的中性物质。     

高效杀灭松材线虫药物配制

为了寻找高效、安全杀线虫药物,本研究通过实验考察茶皂素(TS)、甲维盐等对松材线虫(Bursaphelenchus xyloplilus)的毒性作用,分离、培育松材线虫作为室内实验对象,测定不同浓度TS溶液、甲维盐溶液、TS和甲维盐混合溶液的杀线虫活性。结果表明,TS溶液、甲维盐溶液、TS和甲维盐混合溶液均具有较强的杀线虫活性,10mg/m L TS和1.2mg/L甲维盐混合溶液处理8h能100%杀灭实验松材线虫。     

放线菌BJLSH9菌株兼抗线虫及烟草疫霉菌的生防活性及其杀线虫代谢产物鉴定

 从采自北京柳树的根际土中分离到对线虫和病害真菌具有较好生防活性的放线菌菌株BJLSH9.该菌株对烟草疫霉菌丝生长抑菌率达50.05%,48 h的杀线虫活性高达98.05%.在40 L发酵罐用38号培养基培养BJLSH9菌株,根据其生物活性及菌体生物量确定适宜的发酵时间为72 h.经16S rRNA基因分析,将BJLSH9菌株鉴定为黄抗霉素链霉菌(Streptomyces flavofungini).从BJLSH9菌株的次生代谢产物中鉴定出一种杀线虫化合物tryptophandehydrobutyrine diketopiperazine (TDD),该化合物对线虫48 h的致死率为40%.黄抗霉素链霉菌及其产生的TDD化合物的杀线虫活性为首次报道.