人肝癌细胞移植瘤QGY-9204中细胞调亡和坏死并存现象的初步分析

关于细胞调亡和坏死的判别标准及其相互关系已逐渐成为研讨的热点．研究表明,p53基因的表达导致细胞周亡,抑制肿瘤形成．在将Ad／p53导人人肝癌细胞移植瘤QGY－9204的研究中发现,实验组与对照组的移植瘤中均出现凋亡特征指标（DNA梯型条带、凋亡小体等）．而离体培养的肝癌细胞QGY－7703并未检出细胞凋亡现象．那么,实体瘤的DNA梯型条带与调亡和坏死有何关系？研究表明,瘤体内细胞阔亡和坏死并存,与对照组相比,实验组的瘤体积较小,坏死面积小,凋亡比例较高．对移植瘤QGY－9204中细胞调亡和坏死的特征及其并存现象的可能原因进行了初步分析,推断：在该移植瘤内,凋亡和坏死并非是细胞死亡的两种相互排斥的选择,它们可能相继发生和互为影响．     

野生型p53基因重组体腺病毒介导的肿瘤抑制作用

采用同源重缚方法构建了野生型ｐ５３全长ｃＤＮＡ的重组体腺病毒，通过转导人卵巢癌细胞系ＳＫ－ＯＶ－３和黑色素瘤细胞系ＷＭ－９８３Ａ，证实腺病毒能介导ｐ５３基因进行有效转移，并能显著抑制这两种肿瘤细胞的生长和集落形成能力，生长抑制率分别这到９３％和８６％，对两种肿瘤细胞裸鼠皮下移植瘤的治疗实验表明，ｐ５３能明显抑制肿瘤的生长，流式细胞计数ＤＮＡ片段化及ＴＵＮＥＬ分析证实，Ｐ５３可诱导肿瘤细胞凋亡和Ｇ１     

DDP对裸鼠人体卵巢癌的治疗作用

通过测量肿瘤体积以及应用流式细胞仪、ＡＧ－ＮＯＲ、Ｐ５３抗癌基因检测细胞ＤＮＡ含量，观察ＤＤＰ对裸鼠人体卵巢癌的治疗作用，结果表明ＤＤＰ有抑制肿瘤细胞ＤＮＡ含量的作用，ｐ５３基因与ＤＮＡ损伤药物诱导的细胞凋亡有关，进一步证实ｐ５３基因参与细胞生长与调控。     

血管内皮细胞凋亡过程中几种癌基因表达的研究

为了研究细胞凋亡的分子调控机制,用光学显微技术、ＤＮＡ凝胶电泳和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法,研究了去除生长因子和蛇诱导的两个血管内皮细胞凋亡系统中ｐ５３、ｃ－Ｈｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ和ｂｃｌ－２基因的表达。发现去除生长因子诱导细胞的凋亡过程中,Ｐ５３基因表达显增加,ｃ－Ｈ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ基因表达无变化;蛇毒诱导细胞凋亡过程中,Ｐ５３有达显增加ｃ－Ｈ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ基因表达无变化。在正常生     

人肿瘤细胞株中细小病毒H—1的DNA扩增与非结构蛋白NS—1基因…

研究三株人癌细胞和两株对照细胞对细小病毒Ｈ－１杀伤作用第三性的分子机制，表明了感染复ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）为５ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／细胞的情况下，作为Ｈ－１病毒复制受纲细胞的人癌细胞株ＱＧＹ－７７０３和人胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１，能够支持病毒ＤＮＡ扩增和非结构蛋白ＮＳ－１基因的表达，这和作为阳性对照的由ＳＶ４０转化的新生儿肾细胞株ＮＢ－Ｋ     

姜黄素诱导人胃腺癌MGC80-3细胞凋亡研究

以５、１０和２０μｍｏｌ／Ｌ姜黄素处理ＭＧＣ８０－３７２ｈ,细胞存活率随药物浓度及处理时间依赖性下降,并呈现典型的凋亡细胞形态,以０、１０、２０及３０μｍｏｌ／Ｌ姜黄素处理细胞２４ｈ后,２０μｍｏｌ／Ｌ,以上的处理组ＤＮＡ琼脂糖电泳显示均有典型的凋亡梯形条带,同样条件处理后分别对断裂及未断裂ＤＮＡ作定量测定,计算细胞凋亡率分别为７．３％,３９．２％,５０．５％和６４．３％,表明姜黄素具有诱导ＭＧＣ     

人肝癌裸鼠移植癌株HHC_4、HHC_（15）分子病理学研究

厦门市同安地区已成为中国第二肝癌死亡率高发区。我们对从该地区建立的人肝癌裸鼠移植瘤株，（ＨＨＣ＿４、ＨＨＣ＿（１５））细胞ＤＮＡ进行分子生物学研究。应用ＰＣＲ方法，我们证明了ＨＨＣ＿４、ＨＨＣ＿（１５）癌细胞ＤＮＡ都有ＨＢＶＤＮＡ整合。通过ＤＮＡ测序，我们证明了ＨＨＣ＿４ＤＮＡ有ｐ５３基因第２５０密码子的突变；ＨＨＣ＿（１５）有ｐ５３基因第２４９密码子的突变。这为本地区肝癌死亡率与高ＨＢＶ高感率和／或黄曲霉素Ｂ＿１在食品中高污染率的关系提供有力的分子病理学证据。     

人肿瘤坏死因子Gln102—Glu107缺失型的构建…

基于对有关肿瘤坏死因子结构和功能关系研究资料的分析，设计了一种缺失了Ｇｌｎ １０２－Ｇｌｕ１０７位共６个氨基酸的新型肿瘤坏死因子，首先，利用ＰＣＲ技术分析扩增出Ｖａｌｌ－Ｇｙｓ１０１和Ｇｌｙ１０８－Ｌｅｕ１５７基因片段，连接后再克隆到表达载体ｐＪＬＡ５０３中，转化大肠杆菌，发酵时进行４２℃诱导表达，得到了新型肿瘤坏死因子ＣＧ－ｈＴＮＦ的产物。经过对ｐＣＧ－ｈＴＮＦ中克隆的基因进行ＤＮＡ测序鉴定，证     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

人rabl3基因克隆和表达

以人的胚胎ｃＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法筛选获得ｒａｂ１３基因，并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３和原核表达载体ｐＧＥＸ、ｐＥＴ－１５ｂ和ｐＭＡＬ－ｃ２中，把ｒａｂ１３基因转染入牛肾上腺毛细血管内皮细胞（ＢＣＥ细胞）中，免疫荧光染色显示Ｒａｂ１３定位于ＢＣＥ细胞胞质内膜性细胞器上，在为ｒａｂ１３基因对膜通道调节功能的进一步研究打下了基础。     

利用酵母Two-hybrid系统筛选编码产物与p53相作用的人类基因

用酵母ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ系统在人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中寻找编码产物与ｐ５３相互作用的基因。在１．５×１０６个转化子中筛选到６８个初级阳性克隆。通过测定转化子第二轮β－半乳糖苷酶活力发现，人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中有一个阳性克隆中的ｃＤＮＡ编码产物与ｐ５３反应结果为明显阳性，说明两个蛋白之间存在较强的相互作用。用热测序法测得这段ｃＤＮＡ的序列通过查询基因数据库发现，这段ｃＤＮＡ编码人的泛肽交联酶，可认为是泛肽交联酶参与ｐ５３在细胞内浓度的调节。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达,…

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中。在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％。以醋酸锌显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ－ＰＡ表达条带，进行复性处理。复性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ－ＰＡ。     

利用酶母Two—hybrid系统筛选编码产物与p53相作用的人类基因

用酵母ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ系统在人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中寻找编码产物与ｐ５３相互作用的基因，在１．５×１０＾６个转化子中筛选到６８个初级阳性克隆。通过测定转化子第二轮β－半乳糖苷酶活力发现，人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中有一个阳性克隆中的ｃＤＮＡ编码人的泛肽交联酶，可认为是泛肽交联酶参与ｐ５３在细胞内浓度的调节。     

细胞凋亡的基因调节

现普遍认为细胞凋亡是基因介导的细胞死亡,大量的实验结果表明导致细胞凋亡的基因有ｃｅｄ３,ｃｅｄ４,ｐ５３,ｃ－ｍｙｃ,Ｅ１Ａ以及ＩＣＥ基因等。抑制细胞亡的基因有ｃｅｄ９,ｖ－ａｂ１,ｖ－ｒａｆ,Ｅ１Ｂ,Ｐ３５,ｂｃｌ－２及相关基因等。这些基因在不同的生存因子以及在不同的细胞中,作用效果不尽相同。     

腺病毒同源重组子的鉴定

携带入ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列的Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＦＮ－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉淀法共转染２９３细胞，经同源重组，共获得６个病毒噬斑。病毒噬斑感染２９３细胞，至出现完全细胞病变效应（ＣＰＥ）后，抽提细胞内的病毒ＤＮＡ，经ＸｈｏⅠ酶切后走凝胶电泳，出现重组腺病毒圾的３．５ｋｂ大小的ＤＮＡ条带，＾３２Ｐ标记的探针ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＦＮ－ｂｐＡ与ＸｈｏⅠ酶切过的病     

SpltNPVp49基因的克隆和序列分析

根据新发现的杆状病毒凋亡抑制基因ｐ４９基因的序列设计了一对引物,以ＳｐｌｔＮＰＶ基因组ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增获得了预期大小的约１．３ｋｂ的ＤＮＡ片段,将此片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上并直接测序。序列分析表明,该片段为ＳｐｌｔＮＰＶ完整的ｐ４９基因开放读码框。与已知的杆状病毒ｐ４９基因的序列同源性为８７％,与之对应的氨基酸序列的同源性高达９３％。它是首次从ＳｐｌｔＮＰＶ中克隆到的抑制细胞凋亡的     

人血小板生成素在COS—7细胞中的暂时表达

利用反转录ＰＣＲ获得的全长人ＴＰＯ ｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ的ＮｈｅＩ位点，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法将其导入ＣＯＳ－７细胞中。。实验表明，所构建的表达质粒在ＣＯＳ－７细胞中转录水平表达，ｈＴＰＯ在真核系统中的稳定表达正在研究中。     

erbB—2表达下调抑制人胃癌细胞增殖与EGF反应性的机制探讨

应用ＤＮＡ重组、基因转染、分子杂交、生长测定、裸鼠成瘤、凝胶迁移率改变分析等方法观察了人胃癌细胞中原癌基因ｃｒｂＢ－２的表达被其反义ＲＮＡ特异抑制后胃癌细胞恶性增殖、ＥＧＦ反应性及相关基因表达的变化。ｅｒｂＢ－２表达下调显著抑制了胃癌细胞的恶性增殖能力、ＥＧＦ的细胞增殖促进效应及对增殖相关基因ｃ－ｍｙｃ，ＥＧＦＲ的促进效应。与此同时，细胞周期蛋白激酶抑制物ｐ２１基因的表达显著增强。对其转录激活机制     

血清浓度对SMMC—7721细胞DNA合成的影响

以人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞为材料研究了不同血清浓度对ＤＮＡ合成和细胞生长状态的影响，结果表明几乎在所有处理中短时无血清培养都能刺激ＳＭＭＣ－７７２１细胞的ＤＮＡ合成，且＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量与培养液中ＦＣＳ浓度成明显负相关，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量比值最高可达３９．３２倍．１８ｈ内，随培养时间的增加无血清培养对细胞ＤＮＡ合成的刺激作用逐渐下降，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量比值从３９．３２倍下降为３．５３倍，     

大肠杆菌—分枝杆菌启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建

报道了大肠杆菌－分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３的构建过程。证明其保留了在大肠杆菌和分枝杆菌之间的穿梭功能，并具有启动子筛选功能。利用构建的ＰＥＱ３质粒，从卡介苗染色体中筛选出了具启动子活力的ＤＮＡ片段。