椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

[目的]分离纯化来源于内生枯草芽孢杆菌YZ-21的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质.[方法]采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法、聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH_4)_2SO_4]双水相体系进行分离与纯化,在此基础研究它的酶学性质.[结果]比较3种纯化方法,最优方法为双水相萃取法,在双水相体系为16%(NH_4)_2SO_4、18%PEG2000、2%NaCl条件下,纯化倍数最高可以达到3.06,酶回收率达到99.26%;酶学性质研究表明,β-甘露聚糖酶的最适反应pH为7.0,最适的反应温度是40℃,pH稳定性在3.0～7.0,热稳定范围在35～55℃之间;Ca~(2+),Ba~(2+),Mg~(2+),K~+,Co~(2+)对酶都有激活作用,而Ca~(2+)激活作用最强,Cu~(2+),Na~+,Zn~(2+),Mn~(2+),EDTA对酶有抑制作用.[结论]利用双水相萃取法较好纯化了β-甘露聚糖酶,酶学性质良好,可以广泛应用于饲料添加剂、纸浆漂白和食品加工等领域.     

产生淀粉糖化酶菌株的分离以及酶性质的初步研究

从霉变物、土壤、醋曲、醋醅等分离出四株产生淀粉糖化酶且酶活较高的菌株,选取酶活最高的菌株vin-1作为出发菌株,初步鉴定为Aspergillus niger,其生淀粉糖化酶活力达到342U/g(干曲),酶最适作用温度为55℃,酶在pH值3．5～4．5之间有较高的酶活,最适pH值为4．0,Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有一定的激活作用,而Fe~(2+)、K~+、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)都有较强的抑制作用,Mn~(2+)抑制作用最大,达到近50%。     

球孢白僵菌017壳聚糖酶的研究I酶制剂的基本特征

球孢白僵菌017突变菌株(Beauveria bassiana 017)在CTN培养基(含0.2～1％壳聚糖,0.075％KH_2PO_4,0.05％MgSO_4,0.05％NaCl,0.001％FeSO_4,0.3％KNO_3,0,1％牛肉膏,pH5.0)中,20～30℃,200r·p·m振荡培养7天,可以分泌大量的胞外壳聚糖酶,对底物水解的最适温度为45～50℃,最适pH值为3.8～4.0。K_m值和V_(max)分别为2.17×10~(-6)M和0.45μmol/min,60℃保温1小时,剩余酶活性为10％,Ca~(2+),Mn~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Cu~(2+)和Fe~(3+)对酶有部分抑制作用,Hg~(2+)和Ag~+则强烈抑制酶的活性。     

耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。     

米曲霉(Aspergillus oryzae)植酸酶的分离纯化及性质研究

从5株霉菌中筛选出1株产胞外植酸酶最高的菌株(Aspcrgillusoryxae;简称霉菌3号)。经发酵,硫酸铵分级沉淀,Sephadex G—100凝胶过滤、SE—Sephadex G—50层析和电泳分离,获得2种植酸同工酶.此两种酶的分子量为40000d,等电点分别为4.5和4.8,最适pH为2.7和5.6,最适温度为50℃,K_m值为50μmol/L。SDS、Fe_~(2+)对酶活力无影响;Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)有激活作用;Cu~(2+)有抑制作用。     

麻疯树过氧化氢酶的分离纯化

麻疯树种仁经抽提、硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B层析、DEAE-Sepharose F.F.层析,获得了纯化的麻疯树过氧化氢酶(CAT).该酶比活力为69.23 U/mg,纯化倍数为37.63倍.经Sephacryl S-300 HR测定,该酶表观分子量为232 kD,SDS-PAGE显示为一条分子量为59 kD的条带,表明该酶是由四个相同的分子量为59 kD的亚基组成.经等电聚焦测定该酶的等电点为4.7.经过温度和pH考察,该酶最适温度为30℃,最适pH为7.0.Mn~(2+)对酶活有促进作用,Zn~(2+)、Cd~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Co~(2+)有抑制作用.6×10~(-3)mmol/L NaN_3以及0.9 mmol/L KCN能使酶活丧失.该酶的V_(max)和K_m分别为5 U/mL·min,1.5 mmol/L.     

蜗牛肠道细菌及其纤维素酶性质

为了探寻功能微生物,用几种不同培养基分离蜗牛肠道可培养细菌并筛选纤维素降解细菌,研究了纤维素酶学性质.结果表明,LB培养基培养蜗牛肠道细菌时菌落种类和数量最多,达3.3×104CFU/m L.刚果红染色显示,7种优势细菌全部具有产酶能力;菌S6粗酶液的内切葡聚糖酶(Cx)和滤纸酶(FPase)活性最高,分别为5.96和2.84 U/m L.对Cx酶学性质初步研究表明:该酶最适反应温度为35℃,在55~75℃时有较高的热稳定性;最适p H为6.0,在p H 3.0~8.0均有酶活力,p H 8.0相对酶活仍为60%;Mg~(2+)、Na~+、K~+和Ca~(2+)对酶反应具有促进作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)和Mn~(2+)为酶反应的抑制剂.研究蜗牛肠道细菌的组成,从中分离高产纤维素酶菌株,为纤维素生物降解转化成可再生能源寻找新的思路.     

海洋贝类肠道弧菌21Z1碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质

由威海海域贝类肠道中分离出一株产胞外碱性蛋白酶的细菌,经16S rDNA分析鉴定为弧菌21Z1。该菌发酵液上清经60%饱和度的硫酸铵溶液沉淀、透析、Sephadex-G100分子筛层析等步骤,获得电泳纯的21Z1碱性蛋白酶,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示其分子量约为31 kDa。酶学性质测定结果显示:该酶最适反应温度为40℃,在20~40℃稳定;最适反应pH为8.5,在pH=8.5~11.0间稳定;Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有激活作用,Fe~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)及Cu~(2+)则不同程度地抑制其活性;该酶的耐盐性检测结果显示,在Na~+浓度为4 mol/L时,残余酶活在62%以上,表明21Z1碱性蛋白酶具有较强的耐盐性。     

链霉菌M1033葡萄糖异构酶的分离纯化及其性质的研究

链霉菌M1033菌株所产的葡萄糖异构酶培养液经二级(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE-Sephadex A50,Sephadex-G150柱层析分离纯化,可得到电泳均一的纯酶。该酶的全分子量为91000左右,由两个相同的亚基组成。其pI为4.3,经糖染色后证明并非糖蛋白;最适反应温度70℃,在该温度下分别以D-木糖和D-葡萄糖为底物,测得最适pH分别为8.0和8.3。该酶为金属激活酶。Co~(2 )和Mg~(2 )对该酶有激活作用,Ca~(2 )则使之几乎失活。金属离子的激活作用随底物而异。动力学研究表明,该酶对D-木糖有更大的亲和性。     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

低温淀粉酶菌株分离及其酶学性质研究

通过淀粉底物平板从南极土壤中分离筛选出一株产淀粉酶的菌株,通过16S rDNA鉴定为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)菌株.酶学性质表征发现该酶的最适温度为20℃,最适pH为9.0.摇瓶发酵2 d,酶的比酶活为15.7 U/mg.Ca~(2+)和Mg~(2+)对其有激活作用,而Hg~(2+)和Ni~(2+)是该酶的强力抑制剂.同时,该酶不但可以水解直链淀粉,还可以水解支链淀粉,表现出较宽泛的底物选择性.以上结果表明Arthrobacter oxydans产生的淀粉酶符合低温淀粉酶的特性,在食品上有一定的应用前景.     

过渡金属离子协同紫外活化过硫酸盐

为研究不同过渡金属离子协同紫外(UV)活化过一硫酸盐(PMS)的能力,以Co~(2+)为基准进行Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(3+)协同紫外活化PMS的对比实验。结果显示:Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(3+)与单独紫外和单独PMS联合均不能有效降解目标物;与Co~(2+)/PMS/UV体系相比,Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(3+)协同紫外活化PMS的能力高于Co~(2+),其中Cu~(2+)、Mn~(2+)和Fe~(3+)的协同能力高于Ni~(2+)和Zn~(2+);投加叔丁醇(TBA)和乙醇(EA)的实验发现,Cu~(2+)/PMS/UV、Mn~(2+)/PMS/UV和Fe~(3+)/PMS/UV体系中的主要氧化物是硫酸根自由基(SO_4~-·)和少量的羟基自由基(HO·)。Cu~(2+)/PMS/UV、Mn~(2+)/PMS/UV和Fe~(3+)/PMS/UV体系中AO7的降解过程均符合假一级动力学。紫外可见光谱图分析结果表明,Cu~(2+)/PMS/UV、Mn~(2+)/PMS/UV和Fe~(3+)/PMS/UV体系中AO7均被有效降解。M/PMS/UV对于染料类物质具有广泛的应用范围。     

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.     

结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定

从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40. 06 k D.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45℃和55℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7. 0,都具有较好的pH稳定性.Mn~(2+)、Fe~(2+)对两者具有激活作用,Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、NH_4~(2+)和Mn~(2+)对其都具有抑制作用.EGT的K_m=3. 09 mg/mL,比酶活为98. 4 U/mg; EG的K_m=8. 654 mg/mL,比酶活为53. 53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强.     

短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶初步分离纯化与酶学特性研究

将实验室克隆得到的E. coli BL21/pET28a-bga B-18重组菌株在IPTG的诱导下进行表达,对其表达的β-半乳糖苷酶性质进行研究.首先,通过离心收取重组菌菌体;其次,通过超声破碎菌体细胞,再用镍柱对重组蛋白质进行亲和层析;最后,收集层析液,再利用紫外分光光度计测定重组β-半乳糖苷酶活性,并研究其酶学性质.结果表明:该酶的最适反应温度为37℃,最适pH值为7.5;在温度30～50℃、pH 6.0～8.0范围内酶稳定性较好; Mg~(2+)、Mn~(2+)为其激活剂,Cu~(2+)为其抑制剂;测得K_m=0.816 mmol/L,V_(max)=45.87 mmol/(L·min).     

具有Dawson结构的过渡金属杂多钨磷酸盐的氧化还原性质研究

采用极谱和循环伏安法,研究过渡金属杂多钨磷酸盐K_x[P_2W_(17)ZO_(62)]·nH_2O(Z=Ti~(4+),Mn~(2+),Fe~(3+),Co~(2+),Ni~(2+),Cu~(2+),简写为P_2W_(17)Z)在溶液中的氧化还原性质,发现杂多阴离子的第一极谱半波还原电位E_(1/2)的顺序为Cu~(2+)>Ni~(2+)>Co~(2+)>Fe~(2+)>Mn~(2+)。分析了循环伏安峰电位与pH的关系,提出了它们的还原机理,讨论了过渡元素对杂多阴离子氧化还原性质的影响。     

极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

选择来源于极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis(DSM12029)的普鲁兰酶基因,以购自德国菌种保藏中心的基因组为模板,扩增出普鲁兰酶基因TM-pulA;利用酶切酶连构建了重组质粒pET21a-TM-pulA;转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达并经纯化后,进行了水解产物分析和酶学性质测定.结果显示:TM-pulA为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH为5.8;最适温度是80℃;70℃下半衰期为4.75 h;Mn~(2+)、Co~(2+)、AL~(3+)、Fe~(3+)、SDS及EDTA对其酶活有不同程度的抑制作用;该酶的K_m、V_(max)、K_(cat)及K_(cat)/Km值分别为4.68 g·L~(-1)、0.0085 mmol·L~(-1)·s~(-1)、71.18 s~(-1)、15.21 L·g~(-1)·s~(-1).     

刺槐幼苗中L-亮氨酸氨基转移酶的提纯和特性

<正>刺槐幼苗中的L-亮氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.6,LAT)经热处理、硫酸铵沉淀、Sephadex G-100和DEAE-纤维素柱层析被提纯61倍,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一的带。这种酶的分子量为7×10~4,最适pH为9.0,最适温度为60℃,它对L-亮氨酸的km为2.5mM,对α-酮戊二酸的km为3.5mM;全酶的吸收光谱在230和280nm显示两个主峰,在320和425nm显示两个小峰,透析后320和425nm的小峰基本消失;这种脱辅基酶蛋白无活力,但与100μM磷酸吡哆醛保温1～4h便可恢复活力80～100％,这表示刺槐LAT的辅基是磷酸吡哆醛;一些羰基试剂和底物类似物(二羧酸)能抑制这种酶的活力,除Co~(2+)外,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对酶活力都无抑制,1×10~(-4)MHg~(2+)和1×10~(-3)M金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)对酶无抑制作用暗示,刺槐LAT没有对活力所需要的硫氢基和金属离子。     

黑曲霉HD-404酸性蛋白酶若干动力学性质的研究

研究金属离子、EDTA、表面活性剂、碘乙醚等对黑曲霉HD-404酸性蛋白酶活力的影响的结果表明:Cu~(2+)、Mn~(2+)对酶有明显的激活作用;Cu~(2+)、Mn~(2+)和Al~(3+)同时使用时,产生协同效应,显著提高酶活力;十二烷基磺酸钠(SDS)、西湖高效洗洁剂对酶有明显的抑制作用;在以酪蛋白为底物时,AgNO_3是酶的不可逆抑制剂。     

饲用耐酸抗蛋白酶β–甘露聚糖酶的筛选分离及酶学性质

β–甘露聚糖酶作为饲料添加剂,不仅可以有效降解并消除饲料中的抗营养因子,还可以进一步增强动物的免疫反应并调控动物胃肠道中的微生态平衡.然而目前已发现的大部分β–甘露聚糖酶的酸稳定性差,并且容易被动物肠道中的蛋白酶所降解,因此很难在实际应用中发挥理想的效果.本研究从一株高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)中分离纯化到一种新型β–甘露聚糖酶,并对其酶学性质进行了研究;结果显示:该酶的最适作用温度为50,℃,最适催化pH为5.5,Zn~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)对该酶有明显的激活作用.稳定性研究表明:采用pH 2.0的酸性缓冲液处理1,h后,残余酶活仍能保持70%,以上;进一步采用20,U/m L的猪胰蛋白酶处理2,h,残余酶活仍在60%,以上,表明该酶不仅具有较好的酸稳定性,还对来源于猪胰腺的蛋白酶具有一定的抗性.这些研究结果显示:该酶作为一种新发现的β–甘露聚糖酶,在饲料行业中具有较好的研究前景和应用价值.