小鼠胚胎移植研究

目的研究不同时期胚胎对胚胎移植成功率的影响以提高胚胎移植率。方法采用经超量排卵的KM雌鼠与正常615雄鼠交配,取受精卵,分别将单胚卵、双胚卵、桑椹胚和囊胚、移入发情的假孕KM雌鼠的输卵管和子宫中妊娠产仔。结果移入单胚卵、双胚卵、桑椹胚和囊胚的假孕母鼠妊娠率分别为36.36%、42.86%、10%、27.27%,产仔率分别为46.58%、38.46%、58.33%、60%。结论移植双胚卵可提高小鼠的胚胎移植成功率。     

昆明小鼠胚胎输卵管移植技术研究

目的通过研究不同输卵管胚胎移植方法、不同细胞类型及适宜胚胎的数量对移植后妊娠率和产仔率的影响,旨在提高小鼠胚胎移植效率。方法分别将1-细胞、2-细胞和8-细胞胚胎、移入发情的假孕KM雌鼠的输卵管,选择最适宜的胚胎类型用以研究最合理的胚胎移植数量,以及比较输卵管伞移植和膨大部移植两种方法的优劣。结果2-细胞胚胎移植后的妊娠率显著高于1-细胞和8-细胞处理组（66.67%vs25%,33.33%,P〈0.05）;每只小鼠输卵管移植25个2-细胞胚胎后的产仔率显著高于15个和35个两处理组（36%vs16.67%,10.71%,P〈0.05）;采用输卵管壁切口移植的妊娠率和产仔率显著高于输卵管伞移植（50%vs75%,38.9%vs49.3%,P〈0.05）。结论采用25枚左右的2-细胞期胚胎通过输卵管壁切口移植的方法可以取得较高的输卵管移植成功率。     

不同遗传背景小鼠输卵管移植效率的研究

目的 选用不同遗传背景的小鼠,研究移植不同胚胎数量对产仔率的影响,旨在提高小鼠的移植效率。方法 本研究主要采用输卵管移植技术将2-细胞胚胎移植至假孕鼠体内,对妊娠母鼠的产仔数量进行统计分析。结果 与封闭群相比,近交系的移植效率较低,平均产仔率为37.5%,封闭群则为45%。免疫缺陷动物对移植的胚胎数量要求较高,每只小鼠单侧移植11～15枚细胞时的产仔率最高,为63.5%;不同类型小鼠的平均产仔率比较：C57BL/6J(49.8%)>KM(45.8%)>ICR(44.1%)>NOD-SCID(35.6%)>BAL B/c-nu(29.3%)。ICR、C57、NOD-SCID三种小鼠移植胚胎数量在11～15枚时,产仔率最高;而KM小鼠移植胚胎数量在16～30枚时,产仔率最高;BALB/c-nu小鼠移植胚胎数量≤10枚时,产仔率最高。结论 不同遗传背景的小鼠输卵管移植效率不同,相同遗传背景小鼠移植产仔率随移植胚胎数量的不同而有所变化。     

小鼠早期胚胎不同移植方法的建立

目的建立小鼠胚胎移植技术,探索小鼠胚胎输卵管伞部移植、输卵管剪口移植和子宫移植技术要点,为进一步将该项技术应用到生物净化等领域提供参考数据。方法对4周龄C57BL/6雌性小鼠采用腹腔注射7.5 IUPMSG(孕马血清促性腺激素),48 h后腹腔注射7.5 IU HCG(人绒毛膜促性腺激素)进行超数排卵处理,并与C57BL/6雄鼠合笼,分别在见栓0.5 d、1.5 d和3.5 d取出相应胚胎,对所得胚胎进行筛选,将质量较好的胚胎选出,并将相应胚胎阶段(单细胞、2细胞、囊胚)移入同期发情并经KM结扎雄鼠交配刺激后见栓的KM假孕小鼠输卵管或子宫内,待妊娠生产后得到移植小鼠。结果对88只4周龄雌性C57BL/6小鼠进行超数排卵处理,见栓62只,共取得单细胞胚胎510枚、2细胞期胚胎400枚、囊胚35枚,采用输卵管伞部移植、输卵管剪口和子宫移植,共移植假孕母鼠43只,妊娠生产39只,产仔361只。结论输卵管伞部移植与输卵管剪口移植比较无显著差异,输卵管伞部移植对动物伤害较小,但对术者要求较高;输卵管剪口移植操作较快捷,但对动物损伤较大;子宫移植的妊娠效果最好,处于这一阶段的胚胎极易着床。     

Wistar大鼠超数排卵及胚胎移植

不同剂量激素对Wistar雌鼠超数排卵,并与正常雄鼠交配,收集2-细胞胚胎进行输卵管移植,收集8-细胞胚胎进行子宫移植,结果发现每只Wistar雌鼠间隔48h分别腹腔注射50IU的PMSG与hCG,Wistar大鼠的超数排卵效果最好,平均可获得2-细胞胚胎36.3±15.8枚,输卵管移植后产仔率为73.33%,平均可获得8-细胞22.6±13.1枚,子宫移植产仔率为75.00%.     

人输卵管上皮细胞共培养系统对小鼠胚胎体外发育的影响

常规体外培养的胚胎桑椹胚以上发育率低,胚胎质量不高及移植环境不适合可能是导致IVF-ET成功率低下的原因。目前,国外一些实验室尝试将多种哺乳动物乃至人的胚胎与输卵管组织或上皮细胞进行共培养,发现有促进胚胎体外发育及提高妊娠率的作用,本课题组将人输卵管上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对胚胎体外发育及胚胎质量的影响。结果显示：共培养的胚胎24h后大部分发育到4细胞期以上,发育快的已达桑椹胚。培养48h后共培养的胚胎大部分发育成桑椹胚,有些已开始形成囊胚腔。到72h,正常发育的共培养胚胎形成囊胚和孵出囊胚。3个观察…     

小鼠胚胎移植技术优化及对巨细胞病毒净化研究

目的 建立小鼠巨细胞病毒净化方法,以获得无MCMV感染的小鼠。方法 利用胚胎移植技术,通过使用不同激素、不同发情周期注射激素、受体鼠品系、不同的移植方法、不同时期胚胎移植,以及移植胚胎数量等对比试验,优化了净化条件。利用优化的胚胎移植净化方法,对供体鼠进行了净化。结果 SIGMA生产的激素,在10 IU剂量下超排得到的可用胚胎数量约为17枚/只;在小鼠发情间期超排得到的可用胚胎最多,超排的可用胚胎数约为23枚/只;选取C57雄性小鼠与ICR雌性小鼠交配的子一代作为受体鼠,产仔率达44.5%;输卵管移植较子宫移植效果好,产仔率为40.64%;移植2细胞胚胎的妊娠率为80%,明显优于单细胞和8细胞;受体鼠移植24枚胚胎时,产仔率达到了43.75%。利用优化的小鼠巨细胞病毒胚胎移植净化方法,净化得到了无MCMV感染的小鼠。结论 建立了小鼠巨细胞病毒净化方法,为获得无MCMV感染的小鼠种群提供了可靠的保障。     

小鼠胚胎移植技术方法比较

以近交系小鼠C5 7BL 6J、BDF1 小鼠作为供体胚小鼠 ,封闭群昆明种小鼠作为代母 ,对实验小鼠胚胎移植的三种方法 ,即 :对小鼠受精卵 (或 2个细胞期胚 )经由代母输卵管口移植、经由代母输卵管壁移植及对小鼠进行子宫移植 (8细胞期胚 )的方法了进行实验研究 ,并对各方法适于使用的动物对象、实验要求、产仔率、优势与不足等做了进一步的探讨 ,为今后的实验动物与动物实验提供参考依据     

屠宰母牛卵巢卵母细胞的体外受精与早期发生

将采自屠宰母牛卵巢的未成熟卵子在含有促性腺激素和牛血清的TCM199或Ham'sF10内培养成熟后,再用以钙离子载体Ionophore A23187诱导获能的牛新鲜或冷冻精子进行授精处理,6～7小时后移入发育用培养液,即含有牛血清及丙酮酸钠的M199或Ham's F10内继续培养。在授精48小时及60～96小时后分别统计了培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率。在部分实验中把发育为4～8细胞期的胚移入经假孕处理过的母兔输印管内培养4～5天或者在原发育培养液内继续培养5～8天之后观察了桑椹胚、囊胚的出现率。结果是培养卵子的受精率及受精卵的卵裂率分别达92.0～97.8％和62.5～67.6％,移入兔输卵管内和在体外条件下继续培养的卵子中分别有3.7～30.8％和4.3～31.0％(发育为外形正常的桑椹胚～囊胚期胚胎(包括扩张囊■及■化囊胚)。     

瘦素对小鼠体外胚胎发育率及胚胎移植后着床率的影响

观察瘦素对体外受精后胚胎发育和胚胎移植后着床率的影响。采用小鼠卵母细胞体外受精后胚胎培养及胚胎移植的方法研究仅受精时添加的瘦素对受精后体外胚胎发育的影响及胚胎移植后着床率的影响。结果表明：1）仅受精时添加不同浓度的瘦素对受精卵发育至四细胞胚、桑椹胚及囊胚的比率均无显著影响（P〉0.05）。2）添加的瘦素剂量为10ng/mL及50ng/mL时胚胎着床率较高,当添加的瘦素剂量为100ng/mL-500ng/mL胚胎着床率未提高,两组差别有统计学意义（P〈0.05）。一定水平的瘦素可以显著提高小鼠的体外胚胎移植后的着床率,高水平瘦素反而对着床不利。受精后至着床前各期胚胎的发育率与受精当时瘦素浓度无关。     

Effects of different nuclear recipients on developmental potential of mouse somatic nuclear transfer embryos

Somatic cell nuclear transfer has been succeeded in procedures of nuclear transfer. One is single nucleartransfer, the other is serial nuclear transfer. Viable animals have been cloned in different species using both me-thods[1—6]. Different nuclear recipients and donors wereused in serial nuclear transfer, namely, transferring thenuclear of reconstructed embryo into enucleated MⅡoocytes[7], transferring the nuclear of reconstructed em-bryos at one cell stage into enucleated zygote[4] and t…     

Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立

目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库。方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率。结果 两组不同杂交组合（Smad2^＋/－♂×Smad2^＋/－♀和Smad2^＋／－×Smad2^＋／－♀）小鼠平均超排卵数分别为14．13枚和24．60枚;复苏率分别为90．16％和91．67％;囊胚发育率分别为73．08％和77．05％。这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异。因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚。结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库。     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

稀土氧化物对小鼠胚胎体外发育和胚胎移植影响的初步研究

将稀土氧化物加入人胚胎常用体外培养液 Ham'sF-10中,对2细胞小鼠胚胎进行体外培养。发现稀土氧化物浓度为50～100ppm 时,胚胎发育速度及发育率明显高于 Ham'sF-10对照组,且发育加快现象在培养的24小时内己出现,浓度200ppm以上时,促生长效应逐渐减弱;800ppm 以上时,胚胎发育受抑制也在24小时内出现。将在 Ham'sF-10和含50ppm 稀土氧化物的 Ham'sF-10培养液中培养72小时后发育的囊胚分别移植入两组各9只受体母鼠,两组的受体产仔率没有显著性差别,仔鼠未见畸形或生长异常。     

小鼠早期胚胎内细胞团分化潜能的研究

用免疫手术去除小鼠早期胚胎的外层细胞或滋养层细胞后，其内细胞闭经２４ｈ体外培养后能够重新形成滋养层，从晚期桑椹胚，早期胚泡和晚期胚泡分离的ＩＣＭ的洋养层分化率分别为７０．３％、６９．３％和１１．１％。晚期胚泡ＩＣＭ的洋养层分化率明显低于早低于早期胚泡和桑甚胚的滋养层分化率，实验结果表明小鼠早期胚泡的ＩＣＭ仍角具有较强的分化为洋养层的能力，但晚期胚泡的ＩＣＭ分化为滋养层的能力明显减弱。从而推断晚期胚     

小鼠四倍体半克隆胚胎发育研究

半克隆(Semi-Cloned)胚胎是通过注射体细胞核到未去核的卵母细胞中产生的。在半克隆胚胎中,体细胞被用来作为精子的替代物。然而,由于异常的染色体分离,构建的半克隆胚胎在激活后形成了非整倍体而导致胚胎发育受到严重影响,不能发育到期。本研究通过抑制小鼠半克隆胚胎在激活过程中染色体数目减半,避免非整倍体胚胎形成,研究四倍体半克隆(TetraploidSemi-cloned,TSC)胚胎的发育和体细胞核的掺入对胚胎发育的影响。结果显示,TSC胚胎的体外发育率显著高于二倍体半克隆胚胎,与正常受精卵及孤雌激活对照无显著性差异,但TSC胚胎的细胞数在桑椹胚和囊胚期比正常二倍体受精胚胎和孤雌激活胚胎少。通过Oct-4染色发现,TSC胚胎囊胚期内细胞团(InnerCellMass,ICM)细胞很少或者没有。移植63个四倍体半克隆胚胎到3只假孕母鼠体内,得到20个胎盘,但没有得到胎儿。组蛋白乙酰化和DNA甲基化检测显示,部分TSC胚胎在囊胚期没有形成正常受精胚胎在ICM和滋养外胚层(Trophectoderm,TE)之间的差异分布。TSC胚胎的基因表达不依赖于细胞分裂次数而依赖于发育时间。虽然TSC胚胎避免了二倍体半克隆胚胎形成非整倍体现象,但由于TSC胚胎没有ICM细胞或ICM细胞很少,所以只能形成胎盘而不能形成胎儿。本实验第一次较为全面地研究了TSC胚胎的发育,同时也为研究体细胞核再程序化、基因打靶技术提供了一种新的途径。     

阻滞和非阻滞品系小鼠早胚体外培养的比较

收集阻滞品系昆明（Kunming,KM）小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠受精卵,以及KM小鼠和B6C3F1小鼠交叉交配所得受精卵,进行体外培养,研究阻滞品系小鼠早胚体外发育阻滞原因。结果表明,卵母细胞内在因素对子一代早胚体外发育的能力影响较大,即体外培养是否发生2-细胞阻滞与卵母细胞有关。     

Effects of different nuclear transfer and activation methods on the development of mouse somatic cell cloned embryos

A group of adult somatic cell cloned mice were obtained by using cumulus cells as nuclei donor cells. To study the effect of different nuclear transfer (NT) and activation methods on the development of mouse cloned embryos, embryos were reconstructed using two traditional NT methods (electrofusion and direct injection) and four activation treatments (electric pulse, ethanol, SrCl2 and electric pulse combined with SrCl2). The data showed that the efficiency of reconstruction using the direct injection method is significantly higher (90.7%) than that of the electrofusion method (49.7%). Parthenogenetic embryos can develop to blastocyst stage with three activation conditions, including ethanol, electric pulse and SrCl2; however, the rates of development to blastocyst after ethanol and electric pulse acti-vation (52.4%, 54.2%) are significantly lower than after SrCl2 activation (76.9%). Treatment of embryos for 6 h with 10 mmol/L SrCl2 was found to be the best condition for activation of parthenogenetic as well as reconstructed embryos. By contrast, reconstructed embryos failed to develop to blastocyst stage after being activated by ethanol. The use of either injection or electrofusion for embryo reconstruction affected the pre-implantation development. However, after transfer in pseudopregnant mice, cloned mice were obtained from both methods.     

乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的 评价用乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎冷冻保存的效果。方法 通过超排卵处理 后与雄鼠交配获得长爪沙鼠 2-细胞胚胎,胚胎在冷冻液 EFS20 中平衡 3 min,然后移入冷冻液 EFS40 中平衡 1 min, 之后将细胞冻存管直接浸入液氮中保存。采用二步法复苏胚胎,复苏后移入改良的胚胎培养液( mKSOM) 中体外 培养。结果 采用该方法冷冻的胚胎复苏后胚胎回收率为 86. 73% ,存活率为 82. 94% ,复苏后存活的胚胎中约 1 / 3 胚胎可以在体外发育到囊胚。结论 乙二醇玻璃化冷冻液适于冷冻保存长爪沙鼠 2-细胞胚胎。