miR-503下调Bcl-2增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的:探讨miR-503通过调控Bcl-2的表达介导肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU对5-氟尿嘧啶敏感性的影响.方法:microRNA(miRNA)芯片筛选BEL-7402与BEL-7402/5-FU细胞中表达差异的miR-503为候选的miRNA;脂质体转染法将miR-503模拟物瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测BEL-7402/5-FU及其亲本细胞中miR-503、Bcl-2 mRNA的表达水平;Western Blot观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达水平;CCK-8法检测细胞药物敏感性的改变.结果:相比于BEL-7402细胞,miR-503在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调,而Bcl-2蛋白的表达水平上调;miR-503过表达后BEL-7402/5-FU细胞中的Bcl-2在mRNA和蛋白水平上表达降低;miR-503转染组的BEL-7402/5-FU细胞活力较miRNA阴性对照组显著降低.结论:miR-503可能通过下调Bcl-2的表达,进而增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性,抑制细胞增殖.     

G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控

POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.     

NO对新生大鼠心肌细胞PKC活性的影响

利用培养新生大鼠心肌细胞，检测NO前体L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)和NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对PKC活性的影响，并探讨内、外源性NO在PKC激动剂佛波指(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)激活PKC中的作用.实验结果表明：培养基中加入L-Arg，PKC活性呈剂量依赖性降低；用L-Arg进行预处理，30 min后加入PMA，PKC活性明显降低，与单纯PMA组相比有显著差异；NOS抑制剂L-NAME本身对基础状态PKC活性无明显影响，但可阻断L-Arg对上述2个效应的影响；培养液中加入NO供体SNP，PKC活性呈剂量依赖性降低；用SNP预处理心肌细胞，5 min后加入PMA，PKC活性与单纯PMA组相比有显著性差异.以上结果表明，内、外源性NO均具有剂量依赖性抑制PKC活性的作用，PKC可能是NO对心肌细胞作用的胞内信号传导通路的关键部位或重要信号分子之一；L-Arg通过NOS先生成NO，NO再对PKC起抑制作用.     

PD-L1表达抑制剂的筛选及其抗肿瘤活性

为了筛选PD-L1启动子活性抑制剂,研究其抑制肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达对机体抗肿瘤免疫活性的调节作用.利用荧光素报告基因检测系统对小分子化合物库中的311种化合物进行筛选,发现硫酸长春新碱(vincristine sulfate,VCR)以浓度依赖性抑制PD-L1基因启动子活性.RT-PCR、免疫印迹实验(Westernblot)等生物学评价实验显示:VCR抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中PD-L1表达以及B16细胞PD-L1蛋白表达和成瘤;VCR增强Jurkat细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性,并促进C57BL/6小鼠细胞因子IL-2和γ-IFN的分泌,增强抗肿瘤活性.研究结果表明,VCR通过抑制PD-L1启动子活性下调肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达,从而解除PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答和杀伤作用.     

P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ(polδ)的催化亚基.体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性.文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达.在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中,p53表达增强;RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制.染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性.荧光显微镜观察发现EGFP-p53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质.在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中,细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平.证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达,且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响.     

Caspase-3在牛膝多糖诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡中的作用

为研究牛膝多糖对肝癌BEL-7402细胞凋亡及相关蛋白Caspase-3表达的作用,采用不同浓度ABPS作用于肝癌BEL-7402细胞48h,MTT法检测细胞生长抑制率,荧光显微镜观察细胞形态变化,Western Blot检测Caspase-3蛋白表达.实验结果表明,ABPS对BEL-7402细胞具有生长抑制作用,促进细胞凋亡,作用机制可能与上调Caspase-3蛋白表达有关.     

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

中药柴胡提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度的影响

目的测定中药柴胡(Bupleurun Chinese DC, BCDC)提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度([Ca2 ]i)的影响,以探索柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制.方法以Fura-2/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用双波长荧光分光光度计分别测定不同条件下的BEL-7402细胞内[Ca2 ]i.结果柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降(P<0.001).结论柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降,为一种钙离子通道阻滞剂(Calcium channel blocker, CCB),提示钙离子通道阻滞作用为柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制之一.     

蛋白激酶C活性下降对Ha-ras基因表达及其调控序列结合蛋白的影响

愈益增多的研究表明,蛋白激酶C(PKC)在细胞增殖和转化调控中占有重要位置,一些癌基因产物影响细胞增殖和转化与肌醇脂代谢信号通路,特别是与PKC活性密切有关;ras癌基因就是其中之一。在ras抗性细胞株内只有当PKC活性超过某一阈值时,ras基因产物才能表现出其转化细胞的能力,并且这种转化能力需要PKC的激活;Hsiao等发现稳定表达PKC的细胞系更易被活化的Ha-ras基因转化。上述实验表明PKC和ras癌基因在转化细胞的过程中表现出最佳的协同效应。但ras基因和PKC之间精确的作用机制至     

中药柴胡提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内VCR蓄积的影响

目的测定中药柴胡(Bupleurun Chinese DC,BCDC)提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内VCR蓄积的影响,以探索柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制.方法高效液相色谱法测定BCDC作用于BEL-7402后细胞内VCR蓄积情况的变化.结果柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内VCR浓度升高(P＜0.01).结论柴胡可以增加VCR在BEL-7402细胞内的积聚浓度,部分逆转BEL-7402细胞的MDR.     

三氧化二砷抑制肝癌细胞端粒酶活性的实验研究

目的：观察三氧化二砷对肝癌细胞株BEL-7402和SMMC-7721端粒酶活性的影响。方法：应用端粒酶多聚酶联反应一酶联免疫测定(PCR-ELISA)方法，检测三氧化二砷作用后，肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721细胞端粒酶活性的变化并比较两种细胞端粒酶对三氧化二砷敏感性的差异。结果：0．25～2．00μmol／L三氧化二砷(24～96h)可抑制肝癌细胞系BFL-7402的端粒酶活性，抑制作用与时间、剂量呈依赖性关系；0．25～0．50μmol／L三氧化二砷对SMMC-7721细胞端粒酶活性没有影响(96h以内)，1．00～2．00μmol/L三氧化二砷可抑制SMMC-7721细胞端粒酶活性(4H8～96h)，有时间、剂量依赖关系。结论：三氧化二砷可以抑制肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721细胞端粒酶的活性；BEL-7402细胞端粒酶对三氧化二砷的敏感性较SMMC-7721细胞端粒酶高。     

siRNA干扰p38α上调人血管eNOS基因启动子转录活性

目的:通过靶向 p38α的siRNA干扰人血管内皮细胞的 p38α信号通路,探索其对血管内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调节作用.方法:利用 Western 印迹检测 siRNA-p38α干扰HUVEC-12细胞后 p38α蛋白的表达,确定 siRNA-p38α的最佳作用时间和浓度,然后通过双荧光素酶报告基因技术检测转染 siRNA-p38α后细胞裂解液的荧光强度,分析eNOS基因启动子的转录活性变化.结果:与对照组比较,siRNA-p38α干扰后 p38α蛋白表达明显减弱,而相应的 eNOS启动子转录活性上调, 以100 nmol/L 的 siRNA-p38α作用 48 h 的效果最佳.结论:siRNA干扰 p38α信号可上调人血管内皮细胞 eNOS基因的转录活性.     

钙拮抗剂异博定增强博来霉素A_5对人肝癌BEL-7402细胞的毒性作用

应用肿瘤细胞增殖抑制、克隆形成、流式细胞术,研究了钙拮抗剂异博定(Ver)与博来霉素A_5(BLM A_5)对人肝癌BEL-7402细胞的影响.结果表明:无细胞毒性作用的Ver(20μmol)增强BLM A_5对人肝癌BEL-7402细胞增殖抑制作用达4倍;100μmol Ver增强BLM A_5毒性达11倍;与BLM A_5单独作用比较,Ver使G_2M期细胞进一步增多.另外,提高胞外钙浓度能增加BLM A_2对人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制作用.     

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16~(INK4a)启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967~-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.     

DNA甲基化对杆状病毒极早期和滞早期启动子转录活性的影响

利用体外DNA甲基化酶和荧光素酶报告系统分析了DNA甲基化对杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的8个极早期和滞早期基因启动子表达活性的影响.研究结果表明,病毒极早期基因ie1和ie0启动子的活性受到甲基化修饰的强烈抑制,pe38启动子活性受到部分抑制;同时滞早期启动子p35、DNApol、lef1、lef3和lef8的启动子则在甲基化处理后得到一定程度的激活.转染的同时用AcMNPV感染细胞,在多数启动子中并没有改变甲基化处理对它们表达活性的影响,但使其影响程度有所减弱.在另一些启动子(pe38,p35,lef1)中,AcMNPV的感染使甲基化的作用基本消失.这些结果表明DNA甲基化对一些杆状病毒启动子的转录活性有一定的调控作用.     

人cidec基因启动子的克隆及 PPARγ 上调其活性大小比较研究

人诱导细胞死亡的 DFF45 样效应因子 C(Cell death-inducing DNAfragmentation factor 45-like c,cidec)可调节脂肪代谢,与动脉粥样硬化有密切联系,研究显示该因子表达受到过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的调节,但其中的表达机制还不清楚。从人肝癌细胞 HepG2 中扩增 cidec基因启动子不同长短片段,分别克隆到虫荧光素酶报告基因载体中;cidec 基因启动子片段重组报告基因质粒转染HepG2 细胞,经 PPARγ 激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,ROZ)处理后,检测荧光素酶活性。结果发现,cidec 基因启动子(-1 800～+150 bp)加 ROZ 前后均无明显变化,而 cidec 基因启动子(-2 289～+150 bp)质粒荧光素酶活性明显增加,且加 ROZ 后活性显著升高(p<0.05)。这表明激活 PPARγ 可能通过 cidec 基因启动子的-2 289～-1 800 bp 区域 PPARγ结合元件而上调该基因转录活性。
     

筛选p53靶向药物的细胞模型的构建

为了筛选可以恢复肿瘤细胞中p53功能的小分子,作者用表达野生型p53的人类直肠癌细胞HCT116建立了一株能够应答激活p53信号通路的荧光素酶报告基因的稳定细胞系,同时用表达野生型p53的人类骨肉瘤细胞U2-OS建立了一株能够应答激活p53信号通路的mCherry红色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系.为了检测筛选p53靶向药物的有效性,利用三种已知的以p53为靶点的小分子药物(cisplatin,doxorubicin以及Nutlin-3)处理这两种稳定细胞系,结果显示p53信号通路在这两个稳定细胞系中均能够被激活.为了探索小分子RNA作为恢复p53功能的靶标药物,并进一步验证这两种细胞模型用于药物筛选的可行性,分别检测了MDM2和MDMX的5个不同shRNA.通过比较HCT116稳定细胞的荧光素酶活性和U2-OS稳定细胞中荧光蛋白的荧光强度,我们筛选出了有效沉默MDM2或MDMX的shRNA.数据表明,这两种细胞模型不仅可用作筛选激活p53的小分子化合物的平台,而且可用于筛选激活p53信号通路的小分子RNA.     

肝癌细胞对三氧化二砷诱导凋亡的敏感性与细胞内谷胱甘肽含量的关系

目的:比较肝癌BEL-7402和SMMC-7721细胞对三氧化二砷(As2O3)诱导凋亡的敏感性差异,探讨细胞内谷胱甘肽(GSH)含量与其作用的关系。方法:不同浓度As2O3作用BEL-7402和SMMC-7721细胞24~96 h,流式细胞仪检测细胞DNA含量,计算细胞凋亡百分率;GSH检测试剂盒检测细胞内GSH含量。结果:0.25μmol/L As2O3作用24 h,有效地诱导BEL-7402细胞凋亡;对SMMC-7721细胞来说,需要用1.0μmol/L As2O3作用24 h才能达到相同的抑制效果。1.0μmol/LAs2O3作用72 h时,BEL-7402细胞的凋亡率为(43.8±0.2)%,SMMC-7721细胞的凋亡率为(12.8±0.2)%,检测BEL-7402细胞内GSH为(18.7±1.4)nmol/mg;SMMC-7721细胞内GSH为(50.8±5.2)nmol/mg,两者比较均有显著差异。结论:肝癌BEL-7402和SMMC-7721细胞对As2O3诱导细胞凋亡的敏感性不同,可能与细胞内GSH含量有关。     

P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ（pol δ）的催化亚基．体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性．文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达. 在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中，p53表达增强; RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制． 染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性．荧光显微镜观察发现EGFPp53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质．在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中，细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平．证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达，且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响．     

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件,将Ｎｏｄａｌ基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些拾报告基因的质粒转化Ｆ９细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶海性。Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ｂｐ,其中含有一个位于－３３ｂｐ处的ＴＡＴＡｂｏｘ,它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性,但其活性不强。