水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

<正>水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf(+)的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4的菌传功能分析

构建了甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）RNA4全长核苷酸序列以及5种编码区突变体的侵染性cDNA克隆，不同结构伯RNA4体外转录物与只含有RNA1，2和3的BNYVV分离物总RNAs混合后分别接种寄主植物番杏（Tetragonia expansa）作为毒源，繁殖后接种甜菜，利用无毒甜菜多黏菌(Polymyxa betae）进行传毒实验，结果表明，RNA4编码区内各种缺失突变均能显著地抑制多黏菌的传播，但插入4个碱基的移码突变体对传毒没有影响，说明BNYVVRNA4中的部分核苷酸序列对于被真菌介体高效传播是必需的，并且可能是在RNA水平上具有功能。     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

猪瘟病毒石门株全基因组cDNA文库构建、序列测定及分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了 1 8对覆盖全长基因组的引物 .应用RT PCR技术从猪瘟病毒石门株感染的猪血中扩增出各相应的cDNA片段 ,分别克隆 ,构建了石门株全基因组的cDNA文库并完成了序列测定 .石门株基因组全长 1 2 2 98nt,其中 5′端和 3′端非编码区长度分别为 373和 2 31nt,中间一个大的开放阅读框长 1 1 6 97nt,翻译成一个包含3898个氨基酸残基的多聚蛋白 .还对石门株序列与其他猪瘟病毒序列进行了分析比较     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病. 对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定, 并与其他已知病毒进行了比较分析. 该病毒基因组全长为29.725 kb, 含11个可读框(ORFs), 由1个稳定区和1个可变区组成, 其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶, 包括两个ORFs；可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs), 分别编码病毒的4个结构蛋白(S, E, M, N蛋白). 此外, 可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs). 此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致. 通过与已知RNA病毒的序列比对, 可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae). 与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示, 已在30个核苷酸位置上检出序列差异, 总体突变率为0.1%, 其中15个变异位点在编码区, 可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变). S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异, 而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应. 与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化. 进化分析表明, SARS病毒可能不是来源于人类, 但没有证据证明是人为制造的. 为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在, 仍需进行更深入的研究.     

赛葵黄脉病毒: 一种含有卫星DNA的双生病毒新种

从云南红河地区表现黄脉症状的杂草——赛葵上分离到病毒分离物Y47. 对Y47进行DNA-A的全序列测定, 结果表明, Y47 DNA-A全长2731个核苷酸, 基因组具有典型的双生病毒科病毒特征, 即编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV1(CP)和AV2共2个ORFs, 互补链编码AC1~4共4个ORFs. 对基因组进一步比较发现, Y47 DNA-A与秋葵黄脉花叶病毒分离物201(GenBank登录号: AJ002451)的同源性最高, 达77%, 而与其他双生病毒的同源性均在76%以下, 表明Y47是双生病毒的一个新种, 命名为赛葵黄脉病毒(MYVV). 利用DNAβ的特异性引物beta01和beta02, 从Y47中扩增到卫星DNA分子(Y47β). 序列分析表明, Y47β全长1348个核苷酸, 至少在其互补链上编码一个有功能的ORF(C1). Y47β的全序列与Multan棉花曲叶病毒和Rajasthan棉花曲叶病毒的DNAβ的核苷酸同源性最高, 为62%~67%, 而与其他已报道的DNAβ的同源性均低于46%. 系统关系树分析表明, 卫星DNAβ分子与其辅助病毒是共同进化的.     

某些动物病毒基因组以及大肠杆菌DNA序列具有原核增强子样功能

自1978年Reddy发现SV40基因组中存在增强序列以来,相继发现许多病毒以及真核基因组中广泛存在这类增强序列。但是,在原核系统中是否存在增强子,尚无定论。1985年我们发现SV40 DNA Hind Ⅲ B片段在大肠杆菌中对人α、β干扰素基因的表达有明显的增强作用。本文采用启动子和增强子样序列检测载体,发现除SV40 Hind Ⅲ B片段以外,痘苗病毒(我国天坛株)Hind Ⅲ K片段、呼吸道合胞病毒(RSV)Bam HI G片段,以及约1.0kb的大肠杆菌DNA片段(JM103-M)均有在大肠杆菌中增强某些原核和真核基因表达的功能。本文还对其作用原理进行了初步分析。     

水稻黄矮病毒基因3的结构分析

从病毒基因组和感病水稻ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆测得了水稻黄矮病毒基因３的核苷酸序列,基因３全长１０６８个核苷酸,包括１９个核苷酸的５‘端非编码区,１６４个核苷酸的３’端非编码区和８８５个核苷酸的蛋白质编码区,可编码一个２９５年氨基酸的蛋白质。     

从烟草上分离的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNA的全基因组结构特征

从我国云南省红河地区表现曲叶症状的烟草上分离到病毒分离物Y8, Y36和Y38. 用14种针对双生病毒粒子的单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定, 结果表明, 病毒分离物Y8, Y36和Y38的抗原表位型与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)相似. 对Y8, Y36和Y38基因组DNA-A全序列进行了分析, 其全长分别为2727, 2730和2730个核苷酸, 均编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV₁(CP)和AV₂两个ORFs, 互补链编码AC₁~AC₄四个ORFs. DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较分析表明, Y8, Y36和Y38均属于TYLCCNV. 从病株Y8, Y36和Y38中还分离到一类卫星DNA分子(DNAb), 全长分别为1338, 1339和1338个核苷酸. 3个DNAb分子的核苷酸全序列的同源性为98%~99%, 且互补链上均含有编码126个氨基酸的C1 ORF.     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定

采用农杆菌浸润方法以及重组的马铃薯X病毒(PVX)表达载体, 研究了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)编码的P14蛋白和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的S6蛋白对植物基因沉默的抑制作用. 绿色荧光蛋白(GFP)表型观察及核酸杂交结果表明, 这2种病毒基因均能够强烈抑制转基因本生烟(16C)中由同源序列引起的gfp基因沉默, gfp基因mRNA的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植株, 并导致PVX感染后的寄主症状加重, 说明它们可能是由病毒编码的RNA沉默抑制因子. 其中, RBSDV S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈.     

从云南分离的烟草曲顶病毒为菜豆金色花叶病毒属的一个新种

从我国云南省保山地区烟草上表现曲顶症状的植株上分离获得病毒分离物Y1,经粉虱传毒及粒子形态观察,证明为菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒,用14种单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定,结果表明Y1与我国及巴基斯坦、印度等国报道的双生病毒的抗原表位型均不同,对Y1基因组DNA-A的全序列进行了分析,全长2746个核苷酸,其中病毒链含有两个ORF,互补链含有4个ORF,Y1与其他双生病毒基因组DNA-A全序列、基因间隔区序列及各ORF编码的氨基酸序列的比较分析表明,Y1是一种新的Begomovirus病毒,定名为烟草曲顶病毒,英文名为Tobacco curly top virus,简称TCTV,TCTV全基因组与印度报道的番茄曲叶病毒和番木瓜曲叶病毒的同源性最高,达85%,而其CP基因与巴基斯坦棉花曲叶病毒分离物72b高度同源,氨基酸水平的同源性达98%。     

猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析

猪瘟病毒是猪瘟的病原体,弄清其基因组的复制与表达是研究猪瘟致病机理、研制抗病毒药物的核心,基因组的非编码区（UTR）是复制和表达的主要调节区,为了确定复制与表达位点在非编码区的具体位置以及主要特征,对猪瘟病毒石门株以及其他毒株基因组的3′和5′非编码区进行了生物信息学的定性、定量与结构分析,分别得到17个毒株的3′UTR和56个毒株的5′UTR与调节复制、表达起始有关的位点以及共有的保守序列和结构成分,这些顺式调控元件可能是复制起始识别位点、宿主细胞转录因子的结合位点和核糖体起始蛋白质合成的作用位点,据此,对猪瘟病毒复制与表达的机理进行了探讨,为进一步实验提供了非常明确的方向,同时也为与猪瘟病毒同科的丙型肝炎病毒、其他瘟病毒以及其他正链RNA病毒基因组复制的研究奠定了基础。     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

烟草花叶病毒及番茄花叶病毒弱毒疫苗N14基因组重组体的构建与侵染性分析

用基因交换的方法将烟草花叶病毒普通株（中国分离物,ＴＭＶ－Ｃｖ）和番茄花叶病毒弱毒疫苗Ｎ１４基因组的运动蛋白（ＭＰ）、外壳蛋白（ＣＰ）基因编码区和３’非编码区嵌合于Ｎ１４和ＴＭＶ－Ｃｖ５’非编码区和复制酶原下游,构建重组病毒克隆ＰＴＮＴ和ＰＮＴ,并进行体外转录和烟草染试验。结果ｐＴＮ和ｐＮＴ体外转录物对烟草均具侵染性：前者感染枯斑三生烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｕｍｃｖ．ＳａｍｓｕｎＮＮ）,等     

“垃圾”DNA的奥秘

依据DNA双螺旋和遗传信息的中心法则,只有编码蛋白的DNA才被认为是有功能的.然而人类基因组大小与蛋白质数量矛盾以及生物体进化与基因组大小的不相关性(即C值悖论),导致科学家对非编码DNA概念的提出,戏称这些DNA为"垃圾"DNA.随着第二代测序技术发展以及数据分析能力的提升,大量研究表明,这些"垃圾"DNA很多都可以在生理与疾病状态下特异性转录.同时,疾病全基因组相关联研究显示,大量与疾病相关单核苷酸多态性位点位于非编码区,这共同证明了它们是有功能的.进一步研究表明,人类基因组中至少75%的序列是转录的,并将这些转录且不编码蛋白质的产物称为非编码RNA.本研究组系统总结了3大类非编码RNA包括微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA的定义和分类以及在疾病中的功能,对这些的非编码RNA的研究将会为疾病的治疗以及诊断方法开启新纪元.     

带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101 BAC克隆的构建及拯救病毒的致病性分析

将整合有禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis, REV)长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒(命名为GX0101)全基因组作为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆进大肠杆菌. BAC载体通过同源重组插入MDV基因组的US2区, 含BAC载体的MDV DNA电转化大肠杆菌菌株DH10B, 鉴定含MDV全基因组的BAC克隆(MDV BAC), 提取BAC DNA, 转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF), 成功拯救出了重组病毒, 命名为bac-GX0101. 将此病毒腹腔接种1日龄鸡, 在攻毒后62 d开始检测到内脏肿瘤, 动物实验结果表明, bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的致病性等方面的影响没有差异, bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力. 该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台.