水稻Sh2基因的分子克隆

实验通过构建以兰姆达噬菌体为载体的水稻基因组文库，用玉米的Ｓｈ２ｃＤＮＡ克隆作为探针，分离出水稻的Ｓｈ２ＤＮＡ克隆。经用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ氏印迹杂交分析，初步证明两个克隆是真实的水稻Ｓｈ２基因的克隆，命名为Ｓｈ２－６４和Ｓｈ２－１０１。     

大鼠APKD基因分子克隆研究

以人ＡＰＫＤ基因探针２１８Ｅｐ６在大鼠基因组文库中筛选到阳性克隆ｐＭ１，经充分鉴定证实含有探针的同源顺序。     

人染色体17q12区雨330kb范围内表达顺序的筛选

用定位于人染色体17q12区带的长约330kbYAC克隆500D09（取自法国人类多态性研究中心YAC库）作为杂交探针，筛选人骨髓、胎脑、胎肾、骨骼肌和睾丸等五种组织的cDNA库（2×105～3×105pfu／库），从中获得102个初级阳性克隆．初级克隆经PCR扩增，分别与人基因组DNA、酵母基因组DNA和人rDNA探针作dotblot杂交分析，排除其中假阳性克隆后，复筛得到32个候选克隆．对其中2个候选克隆B4511和S5511分别测定143bp和147bp序列．经查新和同源性分析，这两个片段与已知基因的同源性均小于50％，提示它们可能是来自于新基因的表达顺序．     

大鼠APKD基因分子克隆研究(Ⅱ)大鼠基因组文库中APKD基因同源顺序的克隆——筛选与鉴定

以人ＡＰＫＤ基因探针２１８Ｅｐ６在大鼠基因组文库中筛选到阳性克隆ｐＭ１,经充分鉴定证实含有探针的同源顺序     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源DNA片段的克隆

利用作者克隆的酿酒酵母基因启动子片段Ｙ８为探针和菌落原位杂交方法，从构建的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＮＮ２７基因组文库中共筛选８个阳性克隆。根据这些克隆中插入片段大小和限制酶切结果，可将其划分为６种，分别命名为ＹＮ１－ＹＮ６．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，这６种ＤＮＡ片段不仅能与６．５ｋｂ的全长Ｙ８探针我，而且均能与ＰｓｔＩ酶切Ｙ８所得的３段ＤＮＡ探针杂交。     

家兔基因文库的建立

根据鸟枪法克隆基因的原则，建立了家兔总ＤＮＡ文库。为适应同位素标记探针法克隆筛选方法，建立了以人噬菌体为载体的文库。每个重组子携家兔基因组ＤＮＡ平均２０ｋｂ，共获重组噬菌体达１０＾６。以人生长激素ｃＤＮＡ为探针，采用噬菌斑原位杂交、斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等操作，对以噬菌体为载体的文库进行了筛选和有效性验证。结果表明：（１）人生长激素与兔生长激素的ＤＮＡ存在相当的同源性，以人生长激素ｃＤＮＡ     

盐藻3—磷酸甘油脱氢酶基因克隆

采用Ｌａｍｂｄａ置换型载体ＥＭＢＬ３构建了盐藻基因组文库，文库大小为１．８×１０４，插入片段大小为１０～２０ｋｂ，从盐藻基因组文库中获得３个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆，斑点杂交证实了原位杂交的真实性     

人类基因组计划及研究

近年来,采用ＤＮＡ序列测定、基因克隆、基因组文库的构建等方法对人类基因组进行了研究,完成了大部分人类基因组的物理图谱、转录图谱及单核苷酸多态性图谱的分析。进而发现、克隆和研究了许多新基因,如青光眼基因、肿瘤抑制基因等,这些结果使人类第一次在分子水平上认识自我,并有助于从人灰基因组中去除有害基因。最后本文探讨了人类基因组研究可能带来的问题。     

鳜鱼基因组(AC)n微卫星富集文库的构建与鉴定

鳜鱼基因组DNA经MseI酶切后,与MseI接头连接,用链霉素和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)8杂交,杂交复合物通过变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T 载体上,转化至大肠杆菌DH5α中,首次成功构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组(AC)n重复类型的微卫星富集文库.测序结果表明,阳性克隆率为60%,说明构建的鳜鱼基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库.鳜鱼富集微卫星文库的建立将为下一步进行鳜鱼微卫星标记的筛选提供了有效的工具.     

产酸克雷伯氏菌基因组文库的构建及鉴定

为了给基因功能研究提供基础,以pWEB~(TM)质粒构建产酸克雷伯氏菌KO108基因组文库,克隆数目为1 329个。通过EcoRⅠ酶切分析随机挑取的20个文库克隆的重组质粒,结果显示所有质粒均有8.2kb载体条带同时含有外源DNA,且外源DNA的带型并不相同,这表明所构建的KO108基因组文库中插入的外源DNA随机性较好。分析外源DNA电泳条带的大小,结果显示克隆的外源DNA片段最小约为25kb,最大约为50kb,平均大小估算为40kb,文库克隆容量约52Mb,证明该基因组文库包含基因组任意一个基因的概率为99.8%,是KO108基因组覆盖率的5倍。该文库的构建为产酸克雷伯氏菌功能基因克隆和比较基因组学研究奠定了基础。     

人染色体17q12区带330kb范围内表达顺序的筛选

用定位于人染色体１７ｑ１２区带的长约３３０ｋｂＹＡＣ克隆５００Ｄ０９（取自法国人类多态性研究中心ＹＡＣ库）作为杂交探针，筛选人骨髓，胎脑，胎肾，骨骼肌和睾丸等五种组织的ｃＤＮＡ库（２×１０＾５～３×１０＾５ｐｆｕ／库），从中获得１０２个初级阳性克隆，初级克隆经ＰＣＲ扩增，分别与人基因组ＤＮＡ，酵母基因组ＤＮＡ和人ｒＤＮＡ探针作ｄｏｔｂｌｏｔ杂交分析，排除共中假阳性克隆后，复筛得到３２个候选克隆，对     

绵羊骨骼肌转录组高通量测序从头组装和特征分析

本实验旨在对绵羊肌肉转录组进行组装分析,以丰富绵羊的基因组并为进一步对绵羊的相关基因的分子遗传学研究奠定基础。选取Illumina Hiseq 2000测序平台对杜泊羊和小尾寒羊的骨骼肌转录组文库进行了高通量测序,并对测序数据进行从头组装分析。结果表明:两个测序文库共得到103058824个长为2×90bp的高质量的测序序列,经从头组装共产生了145524个unigenes。两个文库间有5718个unigenes差异表达,经GO注释分析后发现它们主要分布在细胞、细胞过程和结合条目中。将两个文库的unigenes进一步组装得到70348个平均长为863bp的all-unigenes,其中35201个被注释到Nr数据库,12219个被注释到COG数据库,并与KEGG数据库中的258个功能通路中的蛋白质和氨基酸新陈代谢通路密切相关。     

应用PCR—SSCP技术从显微切割的人染色体17q11—12探针池批量分离单拷贝片段的研究

将ＤＮＡ单链构象多态（ＳＳＣＰ）检测的原理，应用于“显微切割的人染色体１７ｑ１１—１２探针池”批量分离单拷贝片段，取得了很好效果。从筛选出的７４个次级单拷贝中有效地鉴定出３７个非同源的单拷贝片段。这比传统的仅限于长度比较而确认的非同源单拷贝片段（１２个）多出２５个．其中部分已经ＤＮＡ测序证实。结果提示：采用ＳＳＣＰ技术区分相似分子量单拷贝片段的同源性，可显著地提高从“显微切割探针池”分离和克隆非同源单拷贝片段的效率。本文还将一部分单拷贝片段作为探讨，与人基因组ＤＮＡ的限制性片段作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果均只显示单一杂交带，说明单拷贝ＤＮＡ片段的结论是可靠的。     

水稻S_5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料 ,构建了一个覆盖 9倍核基因组的cosmid文库 ,其平均插入片段约4 0kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC2 3D12的R末端为探针 ,从cosmid文库中筛选得到一个阳性克隆R2I19(～ 32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱 ,初步确定为S5区候选克隆。对该克隆的 2个TAC亚克隆TRW15 10 (～ 15kb)及TRW15 17(～ 15kb)进行了初步的生物信息学分析 ,证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性 ,并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

人类染色体中的微切割与微克隆技术

微切割、微克隆是分子生物学的一项新技术，它对于基因的标记与分离、DNA文库的重组及遗传图谱的绘制都发挥着重要作用．笔者介绍了这项技术在人类染色体中的应用情况．     

黄孢平革霉木质素过氧化物酶基因的克隆与分析

用大肠杆菌克隆载体ｐＵＣ１９构建白腐丝状担子真菌黄孢平革霉ＭＥ４４６基因组文库，用分离自ＢＫＭ－Ｆ１７６７菌株的木质素过氧化物酶ｃＤＮＡ片段ＣＬＧ４和ＣＬＧ５为探针，从构建的基因组文库中分离到一个含木质素过氧化物酶基因的重组子ｐＧＬＧ－Ｍ１，对该重组子插入片段所作的限制酶谱结果表明，它与来自ＢＫＭ－Ｆ１７６７的ＧＬＧ２片段的限制酶谱十分相似。     

盐藻（Dunaliella viridis）细菌人工染色体文库的构建和鉴定

盐藻具有极强的耐盐能力，是研究植物耐盐机制的模式系统.为了对其耐盐机制进行深入的 研究，以pCC1BAC为载体，构建了盐藻的细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有9 216 个转化子，插入片段平均长度为55 kb，以单克隆形式保藏在96块96孔板中，并建立了四维P CR基因筛选体系，可以通过4轮PCR快速筛选获得阳性单克隆.根据本实验室分离到的两个盐 藻基因的cDNA序列（ DvSPT2和DvTPSP ）设计引物，通过PCR从该文库中各筛到4个阳性BA C克 隆，说明该文库能有效用于分离盐藻基因的基因组序列，据此推测该文库约覆盖4倍盐藻基 因组序列.     

中药植物玉竹微卫星标记的筛选及遗传多样性分析

利用磁珠富集法构建玉竹的微卫星文库,用筛选出的微卫星引物对玉竹样品进行遗传多样性分析。根据链亲和素磁珠和生物素特异结合的特性,用3’端生物素标记的探针与两端连接已知序列人工接头的玉竹基因组DNA酶切片段杂交,杂交复合物结合到包被有链亲和素的磁珠上,洗脱并收集吸附在磁珠上的含有微卫星的片段。经过克隆和测序,再根据微卫星两侧的保守序列设计引物,最后利用从中筛选出的微卫星引物对玉竹种群进行遗传学分析。从基因组微卫星富集文库中分离出9个多态微卫星位点,来自3个玉竹种群的40个个体的多态性显示,每个位点的等位基因数从3到6个不等,观察杂合度范围为0000～0.875,预期杂合度范围为0.520～0.760,多态信息含量范围为0.066～0.687。9个多态位点经哈温平衡检测结果显示有5个位点符合哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡,其余4个位点显著偏离哈温平衡(P0.05)。这可能是存在无效等位基因和或近亲繁殖效应的结果,鉴定出的微卫星遗传标记可以在玉竹的遗传多样性和种群遗传结构的评价中具有潜在的应用价值。     

刊中刊

“人类基因组项目”发表人类基因组序列初稿10周年。为了进行周年纪念，杂志发表了三篇关于人类基因组学的重要论文。来自“美国国家人类基冈组研究所”的EricGreen和MarkGuyer等人介绍了关于基因组医学未来的一个设想。见证了‘八类基因组项目”诞生的EriCLander回顾了基因组学方面已经取得的成就，并对未来前景作了推测。ElaineMardisi讨论了在过去10年推动基因组研究快速发展的DNA测序技术。     

细菌人工染色体(BACs)

文章比较了YACs、BACs、PACs和MACs的主要特点，综述了细菌人工染色体的构建及其在基因组文库构建和基因功能分析等方面的广泛应用．