硫对Ⅰ型玉米金属硫蛋白(Zea mays Metallothionein1)结合金属的影响研究

金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸的低分子量重金属结合蛋白。文章使用紫外吸收光谱技术分析了S~(2-)存在条件下对Ⅰ型玉米金属硫蛋白(ZmMT1)结合Zn~(2+)/Cd~(2+)等金属离子的影响。结果表明ZmMT1对Zn~(2+)和Cd~(2+)的结合能力在S~(2-)存在时明显增强;同时适当增大S~(2-)浓度可以增强ZmMT1结合Cd~(2+)的能力。此外,通过改变组分添加顺序研究发现Cd~(2+)滴定之前,ZmMT1先与S~(2-)温育才可以使S~(2-)成功地掺入到金属巯基螯合簇中,同时最大程度增强ZmMT1的Cd~(2+)结合能力。研究结果显示,通过额外引入硫离子来增加金属硫蛋白的重金属清除特性可能是植物的经济且非常有效的解毒策略。     

铜、锌、镉胁迫下玉米幼苗金属硫蛋白的响应

为研究Zn2+、Cu2+、Cd2+金属离子诱导玉米产生金属硫蛋白,采用实验室溶液培养的方式,通过不同浓度Zn2+、Cu2+、Cd2+(0.05、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L)胁迫下,采用电感耦合等离子体(ICP-MS)测定玉米叶金属硫蛋白(MT)的诱导合成量。随着金属离子浓度的升高,MT的含量呈现先升高后下降的趋势。锌、铜、镉胁迫浓度分别为8.0、0.05和0.5 mmol/L时,玉米叶片中MT含量最高,当铜、镉离子浓度大于2 mmol/L浓度时,玉米出现了一定程度的死亡。研究结果表明玉米可作为锌、铜、镉污染的标志物。     

麻疯树小热激蛋白JcHSP-17.5的纯化与活性鉴定

将实验室已有的pET32a-JcHSP17.5重组载体,经测序验证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,不同温度条件下,用不同浓度异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,优化表达条件;选择镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化JcHSP-17.5蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;通过热激聚合反应来鉴定蛋白的分子伴侣活性.结果表明,17℃,200r/min,0.5mM IPTG诱导13h为JcHSP-17.5蛋白的最佳诱导表达条件,使用200mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白后,每500mL菌液可得到1.345mg的电泳纯蛋白,该蛋白在高温(45℃)条件下能够阻止苹果酸脱氢酶(MDH)发生聚合反应,表现出较强的分子伴侣活性.     

两相滴定法研究稀土离子与吡唑类β-双酮的络合反应

本文用两相滴定法研究1-苯基-3-甲基-4-己酰吡唑酮-5同十五种三件稀土离子及1,3-二苯基-4-苯甲酰吡唑酮-5和1-苯基-3-甲基-4-丁酰基吡唑酮-5同La~(3+),Eu~(3+),Gd~(3+),Lu~(3+)的络合反应,得到萃合物组成随中心离子及配位体变化而变化的结论。同时测定了上述三种配位体的电离常数pK_a~c,两相分配系数Kd,两相电离常数pK_a~cE和络合物的稳定常数β_(31)、β_(30)。     

大肠杆菌表达高性能融合鱿鱼环齿-类弹性蛋白的发酵优化

为了实现重组蛋白SRT-ELP36在大肠杆菌中的高效表达,利用携带重组蛋白SRTELP36基因的pET-25b(+)表达载体,分别在摇瓶和5 L发酵罐上进行了发酵条件优化,并在50 L发酵罐中进行放大验证。经转化表达质粒后,宿主菌BL21(DE3)的菌体生长和蛋白体积产量均高于BLR(DE3),可用于蛋白SRT-ELP36表达。摇瓶发酵条件优化结果表明,TB(Terrific Broth)培养基、装液比(装液量与摇瓶体积之比)为5%、诱导温度为37℃、对数生长结束期添加0.5 mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂,菌体最高OD₆₀₀(波长600 nm处的吸光值)达到22.3,最高蛋白体积产量达0.60 g/L。在5 L发酵罐中进行补料分批培养条件优化,在OD₆₀₀为35时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG启动诱导,并控制过程菌体氧消耗速率(OUR)为(180±5) mmol/(L·h),菌体的最高OD₆₀₀和蛋白体积产量分别达到了88、1.85 g/L,单位菌体蛋白产量为70 mg/g。在...     

转MT工程菌的构建及其对重金属的抗性研究

利用重叠延伸PCR技术克隆金属硫蛋白(MT)和绿色荧光蛋白(GFP)基因片段,并将两基因融合连接构建重组表达载体,采用氯化锂法转化毕赤酵母,获得工程菌株.荧光显微镜观察发现,工程菌在蓝光激发下发出绿色荧光,说明GFP基因被正确表达.在培养基中加入一定浓度的铜(1.0 mmol/L,1.5 mmol/L)、铬(150 μmol/L,200 μmol/L)、镉(120 μmol/L,140 μmol/L)、砷(40 μmol/L,60 μmol/L)化合物后,对照菌生长抑制,转基因菌株长势明显好于对照菌,表现出对金属离子的耐受性,说明工程菌过表达MT能够增强宿主对重金属离子的耐受性,提高菌株耐污能力,在微生物法净化重金属废水中具有一定优势.     

四膜虫金属硫蛋白MTT2在大肠杆菌中的表达与纯化

金属硫蛋白是一种在多种生物中存在的多功能蛋白,纤毛虫金属硫蛋白在结构和功能上具有物种特殊性。从四膜虫Tetrahymena elliotti中鉴定到一种新的金属硫蛋白基因Te-MTT2,该基因全长273bp,无内含子,编码90个氨基酸。为了分析Te-MTT2的功能,分别构建了重组质粒pGST-Te-MTT2和pSUMO-Te-MTT2并转化大肠杆菌BL21.0.05mmol/L IPTG诱导大肠杆菌BL21/pGST-Te-MTT2和BL21/pSUMO-Te-MTT2表达融合蛋白GST-Te-MTT2和SUMO-Te-MTT2.GST-Te-MTT2的表达量占到总蛋白的16.7%,其中29.9%可溶;SUMOTe-MTT2的表达量占到总蛋白的14.2%,其中76.2%可溶。SUMO-Te-MTT2经Ni柱亲和纯化获得电泳纯的蛋白。85℃,15min温浴后,SUMO-Te-MTT2蛋白在10mmol/L PBS溶液中稳定存在。结果表明SUMO表达系统提高了Te-MTT2的可溶性表达,Te-MTT2的表达纯化为进一步分析其生物学功能奠定了基础。     

番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

稀土钐离子与牛血清白蛋白相互作用研究

利用荧光光谱法研究了稀土钐离子(Sm~(3+))与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,探讨了不同pH值的缓冲溶液和不同钐离子浓度对BSA荧光强度的影响.通过改变钐离子标准溶液浓度范围,扫描Sm~(3+)与牛血清白蛋白相互作用的荧光发射光谱,证实了稀土钐离子(Sm~(3+))对BSA的荧光猝灭属于静态猝灭.利用荧光猝灭的Stern-Volmer方程和静态猝灭公式线性拟合,求得反应的荧光猝灭过程速率常数K_q=4.12×10~(12) L·mol~(-1)·s~(-1),结合常数K_a=9.652×10~5 L·mol~(-1),结合数n=1.22.     

稀土β二酮络合物的合成与研究

合成了1-(2-呋喃基)-3-(对甲氧基苯基)-1,3-丙二酮作为新的络合剂,并合成了β二酮与三价稀土离子Ln~(3+)(Ln~(3+)=La~(3+),Pr~(3+),Nd~(3+),Sm~(3+),Eu~(3+),Gd~(3+),Tb~(3+),Dy~(3+),Ho~(3+),Er~(3+))的二元络合物.研究了它们的摩尔电导、热谱、可见紫外光谱、红外光谱等性质.     

稀土元素的共发光效应

在研究铕(钐)-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)-邻菲罗啉(Phen)-表面活性剂荧光体系时发现,于上述体系中加入 La~(3+)、Tb~(3+)、Gd~(3+)、Lu~(3+)、Y~(3+)等稀土离子则使体系的荧光强度增加数十倍乃至数百倍,这是一种新发现的荧光增强现象,我们把它命名为“共发光效应”。本文研究了该效应的形成条件和影响因素以及在分析化学中的应用。     

四膜虫锌指结构蛋白Zfp1影响离子胁迫下金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白对细胞的环境应激起到重要的调节作用,在重金属离子胁迫下上调表达。然而其具体的表达调节机制并不清楚。本研究从嗜热四膜虫克隆了锌指蛋白基因ZFP1(TTHERM-01002770),ZFP1基因无内含子,全长2 160bp,编码719aa。构建了ZFP1敲除载体pN-ZFP1,通过同源重组的方法敲除ZFP1基因获得ZFP1敲除的突变细胞。ΔZFP1对Cu2+和Cd2+的EC50值分别为53.0μmol/L和25.3μmol/L,低于野生型细胞83.1μmol/L和32.8μmol/L.Cu2+胁迫下,ΔZFP1突变细胞中MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的转录水平降低,MTT1转录水平上调;Cd2+诱导下,MTT4转录水平降低,MTT1、MTT2、MTT3和MTT5的转录水平上调,敲除ZFP1基因影响了细胞对Cu2+和Cd2+的耐受性,ZFP1的缺失导致Cu2+和Cd2+诱导下金属硫蛋白基因转录水平变化。结果表明Zfp1参与了金属离子胁迫下嗜热四膜虫金属硫蛋白基因的表达水平。     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

诱导剂对重组人锰超氧化物歧化酶表达的影响

用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、乳糖、巯基乙醇对重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD)工程菌进行诱导，结果表明3种物质都可以诱导rhMn-SOD外源蛋白的表述。通过酶活力、比活测定及电泳的结果显示，以乳糖作为诱导剂的表达效果明显好于IPTG和疏基乙醇，进一步的实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度在80mmol/L。     

贻贝蛋白Mgfp-5的原核表达与纯化

贻贝(Mytilus galloprovincialis)足丝中黏附蛋白,是一种黏合强度高、生物相容性好、优质的生物黏合剂,可以应用于医学、表面化学、海洋工程等领域,其中富含DOPA(多巴,3,4-二羟基苯丙氨酸)的贻贝足丝蛋白5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5,Mgfp-5)显著表现出此特性。天然获取Mgfp-5含量低,易固化,纯化困难,越来越多学者尝试基因工程获得黏蛋白。文中构建重组质粒p ET28a-mgfp,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白Mgfp-5。为得到高质量的Mgfp-5蛋白,优化了Mgfp-5蛋白诱导表达参数:菌液OD_(600)=0.8,诱导剂异丙基-β-D巯基半乳糖苷(IPTG)0.8 mmol/L,37℃,诱导8h;优化镍离子亲和层析纯化蛋白Mgfp-5最佳条件为:Elution Buffer的p H为7.0,500 mmol/L咪唑。Western Blot鉴定到重组Mgfp-5可以特异性表达。该研究为得到大量Mgfp-5蛋白奠定了基础,为加速黏蛋白的黏附机理及生物医学黏合剂的开发提供参考。     

Ca~(2+)和CaM在IAA诱导小麦芽鞘伸长中的作用

应用 Ca~(2+)抑制剂和 CaM(钙调素)拮抗剂,对 Ca~(2+)和 CaM 在 IAA诱导小麦芽鞘伸长中的作用进行了研究.结果表明,小于0.5 mmol/L Ca~(2+)可明显促进小麦芽鞘切段伸长,并能加强 IAA 对伸长的促进,1mmol/L 以上Ca~(2+)则有抑制伸长的作用.Ca~(2+)通道抑制剂 Co~(2+)和 La~(3+)、CaM 拮抗剂CPZ(氯丙嗪)明显抑制芽鞘切段伸长,也降低 IAA 促进伸长的效应.因而,可以认为 Ca~(2+)介入 IAA 诱导细胞的伸长过程,Ca~(2+)通过 CaM 发挥其生理功能.     

花生“汕油523”在盐胁迫下应激反应的初步研究

分别模拟盐胁迫的离子胁迫、渗透胁迫处理花生 (Arachishypogaea L.cv.Shanyou52 3) ,研究了离子胁迫、渗透胁迫对花生抗氧化酶的影响 .结果表明 :等渗的 Na Cl、 KCl(50　mmol/ L、 1 0 0　mmol/ L )和聚乙二醇 (PEG　6　0 0 0 ,1 6%、 2 6% )诱导花生叶片超氧化物歧化酶 (SOD)活力显著升高 ;低浓度 (50　mmol/ L) Na Cl胁迫可以诱导花生叶片过氧化物酶 (POD)活力升高 ;花生叶片过氧化氢酶 (CAT)活力在 PEG胁迫处理下呈显著下降趋势 ,而在 Na Cl和 KCl处理下变化不大 ,表明盐胁迫时引起花生叶片 CAT活力的下降的原因可能是渗透胁迫 .     

金属离子诱导人中心蛋白3的聚集

人中心蛋白3(Human centrin 3,HsCen3)是一种分子量比较小(约20 kD)的酸性、钙离子结合蛋白。在0.01 mol/L Hepes(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid)、pH 7.4和25℃条件下,本文通过荧光共振光散射方法研究了稀土离子(Lanthanide,Ln³⁺)、Ca²⁺诱导HsCen3聚集的热力学性质及离子强度、离子半径等因素对蛋白聚集的影响。结果表明Ln³⁺、Ca²⁺都可以诱导HsCen3形成聚集体,Ln³⁺对HsCen3的聚集效应明显强于Ca²⁺;在HsCen3形成聚集体过程中,其N-端结构域起主要作用、C-端结构域起次要作用;随着稀土离子半径减小,从La³⁺到Lu³⁺对HsCen3的聚集效应逐渐增强;疏水探针占据HsCen3蛋白疏水结构域后蛋白聚集程度减小,推测静电作用力以及疏水作用是促使HsCen3发生聚集...     

Fe~(2+)激活过氧单硫酸盐去除水中氨氮分析

为了有效地去除水中低浓度氨氮,采用二价铁(Fe~(2+))激活过氧单硫酸盐(PMS)的新型高级氧化工艺,对水中氨氮的去除进行研究分析。考察不同初始p H、氨氮浓度(c(NH4+-N)0)、Fe~(2+)与PMS物质的量比(n(Fe~(2+))/n(PMS))及供电子剂对Fe~(2+)/PMS体系去除水中氨氮的影响。研究结果表明:随着p H降低,Fe~(2+)/PMS体系对氨氮的去除效果增强;增加n(Fe~(2+))/n(PMS)可以促进体系对氨氮的去除;随着NH4+-N初始浓度升高,氨氮的去除率呈现下降趋势。当p H=3,PMS初始投量为0.22 mmol/L,n(Fe~(2+))/n(PMS)为1:1,NH4+-N初始浓度为0.044 mmol/L,反应60 min时,氨氮去除率达到最大,为88.27%。另一方面,分别向Fe~(2+)/PMS体系投加单宁酸、柠檬酸、抗坏血酸和草酸等供电子试剂,可以促进体系对氨氮的去除效果,其中单宁酸对其促进效果最佳,使氨氮去除率提高2.60%。Fe~(2+)向Fe3+转化的效率极高,约为91.8%。Fe~(2+)/PMS工艺去除氨氮符合拟一级动力学模型。     

基因重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子的发酵条件优化

采用三角摇瓶来优化基因工程菌表达重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)的最佳发酵条件,并以此为基础在Biotop CF-10L自动控制发酵罐进行发酵培养.基因工程菌BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)诱导表达SCAIF蛋白的最佳摇瓶培养条件是:接种量为2%、装液量为75 mL/500 mL、加入IPTG的诱导时间为培养2 h后、IPTG浓度为0.25 mmol/L、诱导时间为2 h.BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)菌种在Biotop CF-10L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到10 L发酵培养基中,设定pH 7.0,温度37℃,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导2 h后终止发酵.发酵罐中获得的菌体量为10.2 g/L,蛋白表达率为25%左右.