章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose 离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂 (Octopus Trypsin Inhibitor ,OTI)．Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u．性质分析结果表明:OTI在pH=1.0~11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100 ℃下加热1 h、2 h 后仍分别具有90% 和65% 的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (MBSP) 引起的肌球蛋白降解．     

饲料蛋白水平对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)生长和消化酶活性的影响

探讨了饲料中不同蛋白水平（ω（蛋白）分别为20.2%,29.6%,40.8和51.2%）对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）生长和消化酶活性的影响。结果表明,在本实验范围内,饲料中不同蛋白水平对罗氏沼虾的特殊生长率（YSGR）影响不显著（P＞0.05）,对淀粉酶的比活性也无显著影响（P＝0.108）,但显著影响类县蛋白酶（P＝0.017)和胃蛋白酶的比活性（P＝0.002）,在同一蛋白水平下,淀粉酶比活性最高,其次为类县蛋白酶和胃蛋白酶,3种消化酶的比活性在ω（蛋白）＝51.2％组最高,随着饲料中蛋白水平的上升,3种消化酶的比活性也呈逐渐上升的趋势,而淀粉酶与类胰蛋白酶比活性的比值逐渐下降,表明罗氏沼虾消化酶活性对饲料中蛋白含量有适应性反应。     

平板式膜分离免疫球蛋白的研究

该实验研究了用超滤分离和提取免疫球蛋白（ＩｇＹ）的可行性，探讨了平板式膜分离操作参数对通量及免疫球蛋白活性的影响。     

亲和层析分离经胃蛋白酶水解后的猪胰蛋白酶活性产物

猪胰蛋白酶经胃蛋白酶有限度地水解后的活性产物可以用大豆胰蛋白酶抑制剂STI-Sepharose亲和层析方法分离出三种形式的活性分子:K~(**) ,λ~(**)和μ~(**)胰蛋白酶。三者的分子量与母体酶分子β-胰蛋白酶的分子量相同。它们与特异性底物反应时,三者的活性各异。N末端基测定,表明三者N末端氨基酸的不均一性。结果说明,猪胰蛋白酶经胃蛋白酶水解后在一至两个肽键处发生断裂,由于分子内二硫键的连接,并未导致胰蛋白酶肽链的脱落。     

拟穴青蟹新型过敏原磷酸丙糖异构酶的鉴定分析

利用硫酸铵盐析和柱层析对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)进行处理,纯化得到28 ku的新型过敏原蛋白,经质谱鉴定为磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase,TIM）,与中华绒螯（Eriocheir sinensis）TIM序列相似度达到93%。该过敏原蛋白能够与甲壳类过敏患者血清和兔抗克氏原螯虾多克隆抗体发生特异性反应,等电点为5.8。对热处理稳定,加热温度高于50 ℃时发生聚合,且多聚体仍具有免疫结合活性,pH＞9.0时,对TIM免疫结合活性略有影响。在模拟胃肠液消化过程中,TIM耐受胰蛋白酶消化但不耐受胃蛋白酶消化,模拟胃液消化后的小分子片段仍保留有IgG结合活性。综合血清学及性质分析,该磷酸丙糖异构酶是拟穴青蟹的一种新型过敏原。     

紫贻贝加工下脚料抗菌肽的分离及其稳定性研究

以紫贻贝加工下脚料为原料,采用超声辅助乙酸粗提抗菌肽粗提物,筛选其抑菌活性敏感指示菌。在此基础上,以固相萃取、Sephadex G-25层析和半制备RP-HPLC对抗菌肽进行分离纯化及其稳定性分析。结果显示,金黄色葡萄球菌为最敏感菌株,获得的Sp40-2-4和Sp40-2-5组分抑菌活性显著高于抗菌肽粗提物(P0.05),凝胶过滤色谱分析表明Sp40-2-4组分单一,相对分子质量约为1 970.78 Da;Sp40-2-4组分具有一定的热稳定性(100℃、20 min,抑菌活性残留率72.42%)、反复冻融性(冻融次数≤10,抑菌活性残留率91.42%以上)和抗胃蛋白酶水解能力(抑菌活性残留率75.59%)。     

鲍鱼内脏多糖的提取、纯化及其抗氧化和抑菌活性

以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)内脏为实验材料,采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶6种蛋白酶对其进行酶解提取多糖,结果显示碱性蛋白酶酶解所得多糖得率最高,为6.66%,进而由单因素试验和正交试验确定了碱性蛋白酶提取鲍鱼内脏多糖的最佳工艺条件.将得到的鲍鱼内脏粗多糖进行体外抗氧化活性测定,结果显示:100%清除羟自由基、100%清除2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)自由基以及700 nm处吸光度(A_(700))为0.485时代表的还原能力对应的鲍鱼内脏粗多糖质量浓度分别为9.6,7.5,8.2 mg/mL,表明所得粗多糖具有较好的抗氧化活性.采用双酶解法以提高多糖含量,结果显示胃蛋白酶二次酶解所得的多糖含量最高,且多糖样品在3种抗氧化活性模型中均具有很好的效果.采用Sevage法和反复冻融法去除蛋白,过氧化氢脱除色素,进一步纯化得到高纯度的鲍鱼内脏多糖,并采用双层平板法测定其抑菌活性,结果表明其对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coil)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)都具有较好的抑制作用.     

真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

 在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上,通过PCR逐步将编码1-47、178-237及338-381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL 3135植酸酶（Anp）中的对应片段,构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因,并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m(胰蛋白酶)/m(植酸酶)为0.1时,Anp完全失活;但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13%~23%。胰蛋白酶水解产物的SDS-PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解,但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Afp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明,通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。     

类产碱假单胞菌杀虫蛋白理化性质研究

类产碱假单胞菌杀虫蛋白对蝗虫具有较强的杀伤力，在ｐＨ６．０￣１０及４０℃以下，杀虫蛋白的活性是稳定的。该蛋白对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不敏感，不具溶血性。     

N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1，2，4，-三氮唑-1-）乙酰胺的注射液反复冻融的稳定性研究

建立了N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺的注射液的HPLC的分析方法,在此基础上进行了N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺注射液的反复冻融影响因素试验。采用高效液相色谱法测定不同浓度的N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺样品,其拟合峰面积与N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺浓度呈良好线性。在N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺线性范围内计算反复冻融后N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺的含量,结果显示冻融前后其含量没有明显变化。结果表明,N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2,4,-三氮唑-1-）乙酰胺注射液反复冻融后含量及有关检验指标无明显变化,表明N-（2-甲氧基乙基）-2-（3-硝基-1,2, 4,-三氮唑-1-）乙酰胺注射液在反复冻融条件下稳定性良好。     

微藻细胞破碎方法的研究

采用反复冻融和超声波破碎法破碎17种微藻细胞，通过细胞破碎率和抗菌活性检测破碎效果，以选择适合不同微藻的破碎方法，利于胞内活性物质的提取．细胞破碎结果显示：经过12min的超声处理，所有实验藻种的破碎率均在90％以上，特别是扁藻、角毛藻以及球等鞭金藻和甲藻，仅处理3min，破碎率达到了99％以上，更适合超声波法破碎、反复冻融法破碎藻细胞，经过2次冻融，10种微藻的破碎率在95％以上，4种在60％-80％，3种小于40％，对此三种藻（分别是扁藻，小球藻和紫球藻）的破碎应选择超声或组合法；以金黄色葡萄球菌（S.aureus）为指示菌，采用琼脂扩散法检测细胞破碎率对抑菌活性的影响，抗菌活性表明：细胞充分破碎，有利于活性物质的释放和提取．     

鲍鱼水解肽的抗氧化活性评价、组成分析及稳定性研究

通过研究鲍鱼水解肽的清除自由基能力、还原能力来评价其抗氧化活性,测定水解肽的相对分子质量分布情况、氨基酸含量,对鲍鱼水解肽的营养价值进行全面分析. 结果表明：鲍鱼水解肽具有较强清除自由基的能力和还原力;其相对分子质量在107~10031u范围内呈连续分布,其中小于5000u的水解肽占比达82.0%;水解肽由18种氨基酸组成. 当温度在20~60℃,pH值为7、8、10时水解肽的活性无显著变化,金属离子对DPPH自由基的影响随质量浓度增加逐渐增强,经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化5h后,DPPH自由基清除能力保持率分别为（66.03±0.29）%、（109.03±0.57）%.     

乌鳢蛋白消化酶活性的研究

研究了温度及不同蛋白源饲料（泥鳅Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓａｎｇｕｉｌｉｃａｕｄａｔｕｓ和黄豆饼）对乌鳢（Ｏｐｈｉｏｃｅｐｈａｌｕｓａｒｇｕｓ）蛋白消化酶活性的影响．结果表明：温度可显著影响蛋白酶活性;胃蛋白酶、肠道蛋白酶及肝胰脏蛋白酶的最适温度分别为３０℃、３０℃和２５℃;在最适温度及同等温度条件下,胃蛋白酶活性均比肠道蛋白酶及肝胰脏蛋白酶活性高．饲喂后９ｈ,黄豆饼组胃蛋白酶、肠道蛋白酶达最大活性,泥鳅组为１２ｈ．     

血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的酶法制备

以扇贝裙边的酶解产物——蛋白多肽对ACE活性的抑制率作为控制水解程度的指标,确定制备ACE活性抑制肽的最佳酶种及酶解工艺技术条件.通过胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味酶、枯草杆菌蛋白酶5种酶酶解扇贝裙边得到的蛋白多肽对ACE抑制能力的比较发现,5种酶在不同酶解时间所得到的酶解蛋白多肽都具有一定的ACE抑制能力,其中胃蛋白酶酶解蛋白多肽的ACE抑制率最高,为91.33%;再经L9(3)4正交实验对胃蛋白酶酶解工艺条件进行优化,确定酶解反应最佳条件是酶量400 U.g-底1物,pH 2.5,温度32℃,底物浓度(原料∶水)1∶2,酶解时间3 h;试验结果还表明,单酶(胃蛋白酶)的酶解蛋白多肽比复合酶(复合风味酶)和双酶(胃蛋白酶 木瓜蛋白酶)的酶解蛋白多肽对ACE活性的抑制能力都强.     

反应温度对中国龙虾消化酶活力的影响

采用酶学分析方法研究了反应温度对中国龙虾胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活力的影响.结果表明,在设定的反应温度范围内,中国龙虾各消化酶的活力均随反应温度的升高呈现先上升后降低的变化趋势.其中,胃、肠、肝胰腺内,胃蛋白酶最适反应温度分别为31、39、31～47 ℃;类胰蛋白酶最适反应温度均为39 ℃;淀粉酶和纤维素酶最适反应温度均为23 ℃;脂肪酶最适反应温度分别为23、31、31 ℃.中国龙虾的消化酶活力存在器官特异性.在最适反应温度下,中国龙虾不同消化器官内各消化酶的活力顺序为胃蛋白酶:胃肠肝胰腺,类胰蛋白酶、脂肪酶:肝胰腺肠胃,纤维素酶:肝胰腺≈肠>胃,淀粉酶:肠肝胰腺胃;中国龙虾各消化酶在同一消化器官内的活力顺序为胃内:纤维素酶≈胃蛋白酶类胰蛋白酶≈淀粉酶脂肪酶,肠内:纤维素酶类胰蛋白酶≈淀粉酶≈胃蛋白酶脂肪酶,肝胰腺内:纤维素酶类胰蛋白酶淀粉酶≈胃蛋白酶≈脂肪酶.     

干旱及冻融胁迫对黑麦草抗氧化酶活性和脯氨酸质量比的影响

以冬牧70黑麦草为材料, 用聚乙二醇（PEG 6000）模拟干旱胁迫, 设置5%（D1),10%(D2),15%(D3)三种不同程度干旱（轻度、 中度、 重度）以及对照组（CK）, 温度为10,5,0,-5,0,5,10 ℃, 研究冻融及干旱胁迫对幼苗中抗氧化酶活性和脯氨酸质量比的影响. 结果表明： 单一干旱胁迫下黑麦草幼苗中超氧化物歧化酶（SOD）、 抗氧化物酶 （POD）活性和脯氨酸质量比均 增加; 冻融和复合胁迫下幼苗中SOD活性呈先升高后显著下降趋势, POD活性和脯氨酸质量比呈先升高后缓慢下降趋势, 在-5 ℃出现峰值, 与其他温度下的数值存在显著性差异（P<0.05）; 胁迫伤害下整体呈复合胁迫>单干旱胁迫>单冻融胁迫的趋势, 冻融胁迫下的伤害程度为重度干旱+冻融>轻度干旱+冻融>单一冻融>中度干旱+冻融, 复合胁迫对植物伤害出现叠加效应, 适当的干旱处理可缓解冻融对幼苗的生理损害. 因此植物通过提高抗氧化酶活性和渗透调节物质, 可缓解其遇到胁迫时的伤害.     

胰蛋白酶的固定化及其应用研究

通过γ-（2,3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷将胰蛋白酶固定在硅胶载体表面制备固定化胰蛋白酶. 实验测试了pH值,温度,时间等因素对固定胰蛋白酶的影响,利用红外光谱、热失重等方法对固定化胰蛋白酶进行了表征;通过高效液相色谱法考察了在弱碱性条件下固定化胰蛋白酶与16种天然小分子物质的结合情况. 结果表明在25 ℃,pH=8.0,反应18 h的条件下,对胰蛋白酶在硅胶载体上的固定量最大;且固定化胰蛋白酶与黄酮类成分、生物碱类成分、萜类成分有良好的结合,对酸类及嘌呤类小分子物质不结合.      

鲎素抗菌肽的分子结构稳定性及生物活性

为了实现鲎素这种高效、广谱的抗菌肽在生产实践中的应用,采用不同温度、pH值、体外蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶B)分别处理鲎素,通过检测鲎素最小抑菌浓度(MIC)的变化来衡量鲎素的生物活性稳定性;采用高效液相色谱(HPLC)检测鲎素残留量,通过HPLC图谱变化来评定鲎素分子结构的稳定性.结果表明:温度小于120℃、pH值小于11.30时,鲎素对大肠杆菌K88的MIC为1.25～5.00 mg/L;高效液相色谱检测得鲎素残留量在65.46～70.21 μg之间;鲎素对胃蛋白酶的作用表现出很高的稳定性,对胰蛋白酶、羧肽酶B、弹性蛋白酶的作用稍微敏感;在胃蛋白酶酶活浓度不高于5.33 mmol/,(s·L)、胰蛋白酶酶活浓度不高于0.67mmol/,(s·L)、羧肽酶B酶活浓度不高于0.17mmol/,(s·L)、弹性蛋白酶酶活浓度不高于0.021 mmol/,(s·L)的条件下,鲎素仍具有活性.这说明鲎素抗菌肽具有较强的高温耐受性,在酸性条件下具有稳定性,且具有一定的耐受蛋白酶降解的能力.     

干旱及冻融胁迫对黑麦草抗氧化酶活性和脯氨酸质量比的影响

以冬牧70黑麦草为材料, 用聚乙二醇（PEG 6000）模拟干旱胁迫, 设置5%（D1),10%(D2),15%(D3)三种不同程度干旱（轻度、 中度、 重度）以及对照组（CK）, 温度为10,5,0,-5,0,5,10 ℃, 研究冻融及干旱胁迫对幼苗中抗氧化酶活性和脯氨酸质量比的影响. 结果表明： 单一干旱胁迫下黑麦草幼苗中超氧化物歧化酶（SOD）、 抗氧化物酶 （POD）活性和脯氨酸质量比均 增加; 冻融和复合胁迫下幼苗中SOD活性呈先升高后显著下降趋势, POD活性和脯氨酸质量比呈先升高后缓慢下降趋势, 在-5 ℃出现峰值, 与其他温度下的数值存在显著性差异（P<0.05）; 胁迫伤害下整体呈复合胁迫>单干旱胁迫>单冻融胁迫的趋势, 冻融胁迫下的伤害程度为重度干旱+冻融>轻度干旱+冻融>单一冻融>中度干旱+冻融, 复合胁迫对植物伤害出现叠加效应, 适当的干旱处理可缓解冻融对幼苗的生理损害. 因此植物通过提高抗氧化酶活性和渗透调节物质, 可缓解其遇到胁迫时的伤害.     

鲎素抗菌肽分子结构稳定性及生物活性的研究

鲎素是一种高效的、广谱的抗菌肽,已经成为研究热点.为了实现鲎素在生产实践中的应用,研究鲎素在体外分子结构、生物活性的稳定性.本文采用不同温度、pH值、体外蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶B )分别处理鲎素.通过检测鲎素最小抑菌浓度(MIC)的变化,来衡量鲎素生物活性稳定性;采用HPLC法检测鲎素残留量,通过HPLC图谱变化来评定鲎素分子结构稳定性情况.结果表明:在t < 120℃、pH < 10.0作用情况下,鲎素对大肠杆菌K88的MIC为1.25～2.5 mg/L,高效液相色谱检测鲎素残留量在65.5～70.2μg之间;鲎素对胃蛋白酶的作用表现出很高的稳定性,对胰蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶的作用稍微敏感.在胃蛋白酶浓度小于 320 U/mL,胰蛋白酶浓度小于40 U/mL,羧肽酶浓度小于20 U/mL,弹性蛋白酶浓度小于2.5 U/mL作用下鲎素仍具有活性.通过实验得出结论:鲎素抗菌肽具有较强的高温耐受性,在酸性条件下具有稳定性,同时鲎素具有一定的耐受蛋白酶降解的能力.