大鼠胰岛β细胞原代培养的一种实用方法

以Ｖ型胶原酶分离胰腺得到胰岛，在ＥＧＴＡ预处孵育后以低浓度的胰蛋白酶和ＤＮａｓｅⅠ酶联用消化胰岛建立了大鼠胰腺β细胞的分离及原代培养方法。     

小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型,试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。先采用机械分离方法分离子宫平滑肌,再用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法消化,可获得90%以上具有正常代谢活性的小鼠子宫平滑肌细胞,存活的细胞经倒置显微镜观察和免疫荧光染色进行鉴定。原代培养3d后细胞贴壁生长,约2周后细胞汇合成片,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型"峰-谷"样生长,平滑肌细胞肌动蛋白(α-Actin)免疫荧光染色强阳性。采用本法体外培养的小鼠子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于小鼠子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究。     

树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养。方法取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选。结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖最为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11min为宜。结论通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础。     

人胚神经干细胞的体外培养

目的　探讨人胚神经干细胞体外培养的条件和分化情况 ,以摸索出一种切实可行的能获得较纯且多潜能人胚神经干细胞的方法 .方法　采用取 3月龄人胎脑 ,用胰蛋白酶消化法分离单个细胞 ,部分冻存 ,另一部分进行细胞培养 ,加EGF ,bFGF刺激生长 ,有限稀释法获得单细胞克隆 ,血清诱导分化 ,并用免疫组化方法进行鉴定 .结果　EGF和bFGF同时存在于无血清培养基中 ,有大量神经干细胞团生成 ,含血清培养基则诱导神经干细胞分化成为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞 .结论　神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用 .经冻存后的胎脑细胞同样能分离培养出有活性的神经干细胞 .     

大鼠胰岛β细胞原代培养的一种实用方法

以Ｖ型胶原酶分离胰腺得到胰岛，在ＥＧＴＡ预孵育后以低浓度的胰蛋白酶和ＤＮａｓｅＩ酶联用消化胰岛，建立了大鼠胰腺β细胞的分离及原代培养方法．反复实验表明（ｎ＝１０），所获得的细胞表面光洁、完整、呈球形，功能正常，能对生理剌激物迅速反应，适用于通常的单个细胞的电生理学实验．     

兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养和增殖的研究

目的：研究兔和牛角膜上皮、基质及内皮细胞等3种细胞体外培养的生物学特性，探索和改进这3种细胞体外培养的方法，为组织工程角膜奠定基础。方法：采用消化法分离培养兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞，观察细胞贴壁生长情况，同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果：角膜上皮、内皮和基质细胞均在培养48～72h贴壁生长，培养6～9d能形成良好单层，细胞形态典型，进行多次传代后细胞仍维持原有形态和功能，获得的细胞能进行长期培养。结论：为兔和牛角膜上皮、内皮和基质细胞体外培养，提供了简单高效经济的方法。     

绿色荧光蛋白基因在牦牛乳腺上皮细胞中表达的研究

从牦牛乳腺采集组织, 并通过胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法相结合在体外成功分离、纯化到了牦牛乳腺上皮细胞. 通过观察, 具有明显的上皮细胞特征, 而且符合一般细胞的生长规律. 通过脂质体介导法将携带有绿色荧光蛋白的外源基因转染进乳腺上皮细胞中, 在荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白基因的表达.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

不同胰酶消化方法用于制备猴胚肾细胞的评价

为了提高猴胚肾细胞的产量和质量,对生物制品生产中常规使用的四种细胞制备方法进行实验性评价,结果表明热消化法和冷消化法较适合于猴胚肾细胞的制备,冷消化法又优于热消化法,细胞产量高稳定性好,细胞活力强,上述两种方法也适合于幼兔肾和胎猴肺细胞的制备．     

胚胎大鼠肺成纤维细胞的体外培养

目的:探讨胚胎大鼠肺成纤维细胞的体外培养条件.方法:采用胶原酶消化19d胎鼠肺组织块,经差速离心和反复贴壁法,分离、纯化肺成纤维细胞后采用加胎牛血清的DMEM培养液,进行细胞培养.用波形蛋白免疫细胞化学染色对所分离的细胞进行鉴定.结果:细胞培养24h后有一定量细胞贴壁,48h后贴壁细胞开始生长.结论:该实验方法可以成功地培养大鼠胚胎肺成纤维细胞.     

聚苯乙烯薄膜三维培养肝细胞的实验研究

采用三维聚苯乙烯薄膜作为细胞培养支架,在体外进行大鼠肝细胞的三维培养,并与常规二维肝细胞培养进行比较.分析了细胞的生长状态及肝细胞功能,包括细胞存活率、白蛋白分泌功能、尿素合成功能及葡萄糖消耗功能.结果显示:三维细胞增殖活力均始终明显高于二维;在显微镜下观察,可看到三维支架表面黏附生长的肝细胞逐渐增多,有肝细胞黏附成团,且肝细胞保持着良好的形态学结构.研究表明,三维培养的肝细胞其增殖生长和代谢功能都优于同样条件下的二维培养,三维聚苯乙烯薄膜可以作为体外肝细胞培养支架,在生物人工肝培养体系中具有应用前景.     

人羊膜上皮细胞的体外培养及诱导分化

人羊膜上皮细胞由外胚层发育而来,属于成体干细胞,具有来源广泛、免疫原性低、非致瘤性、不存在医学伦理道德限制等优点.研究目的:建立人羊膜上皮细胞的体外分离培养的方法,检测其向三胚层诱导分化培养潜能.在无菌条件下机械分离羊膜,使用胰蛋白酶分步消化法收集人羊膜上皮细胞,体外培养,观察其细胞形态与生长规律;并通过免疫细胞化学法,RTPCR及三胚层定向诱导等方法对其进行鉴定.结果:成功从人羊膜中分离得到纯度较高的人羊膜上皮细胞.免疫细胞化学法鉴定结果显示,分离到的羊膜上皮细胞内的角蛋白19呈阳性;RT-PCR鉴定干细胞标志基因REX1、Oct-4和Nanog,在mRNA水平均有表达;定向诱导条件下,人羊膜上皮细胞可向成脂、成神经和成肝样细胞分化.结论:人羊膜上皮细胞可在体外分离培养,具有干细胞特性,可以定向诱导分化成内胚层、中胚层、和三胚层三个胚层组织与细胞.     

人胚胎脑神经干细胞分离纯化及体外培养的研究

为了探讨人胚神经干细胞体外培养条件下的生物学特性,为其应用于临床治疗奠定基础.取胎龄16周的人流产胚胎,胰酶消化结合机械法分离成单细胞悬液,以2×106个细胞/mL接种到含hEGF和h-bFGF的DMEM/F12、N2培养基进行体外培养;观察细胞生长情况,用10% FBS诱导神经干细胞球分化,免疫细胞化学鉴定. 结果显示从人胚大脑分离出的细胞经悬浮培养可以形成细胞球,表达Nestin蛋白.经诱导分化后具有表达神经元,神经胶质细胞的特异性抗原. 说明人胚神经干细胞在体外可以稳定生长,并能分化成为神经原及胶质细胞.     

牦牛乳腺上皮细胞的体外培养的研究

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牦牛乳腺上皮细胞．形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征．染色体数目分析表明,细胞核型稳定,在离体培养条件下不发生转化．牦牛乳腺上皮细胞染色体数目为60,染色体组型为2n=60．     

人视网膜血管内皮细胞的分离与培养

目的探讨人视网膜血管内皮细胞的体外分离和选择性培养方法.方法将人视网膜通过剪碎、匀浆、过筛、胶原酶消化处理后,结合密度梯度离心和物理刮除等分离方法获得较纯的视网膜血管内皮细胞,接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中,并采用含内皮细胞生长因子和肝素的培养基促进内皮细胞贴壁生长,观察细胞生长状况,并应用免疫组化方法进行鉴定.结果培养的细胞成典型的铺路石样生长,Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性,细胞纯度达98%以上.结论本实验方法简单易行,培养出的人视网膜血管内皮细胞纯度高、生长状态良好,并可稳定传代,为视网膜血管疾病的基础研究提供有效的模型建立方法.     

人脐带间充质干细胞在肝部分切除模型大鼠体内向肝样细胞的分化

目的:探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)移植到肝部分切除模型大鼠体内能否存活并分化为肝样细胞.方法:用胶原酶消化法从人的脐带分离出MSCs,培养并检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标志.取第5代人脐带MSCs用PKH26标记,制作大鼠肝部分切除模型,将标记的细胞经门静脉植入大鼠体内,观察移植后第1、2、3周细胞能否存活,以及移植细胞能否向肝样细胞分化,表达肝细胞的标记物白蛋白.结果:人脐带MSCs能在体外大量扩增,移植到肝部分切除模型大鼠肝脏后细胞能存活,并表达肝细胞标记物白蛋白,PKH26标记后细胞在荧光显微镜下发红色荧光,荧光显微镜下可见肝脏冰冻切片中散在分布的标记细胞,免疫荧光染色大多数标记细胞白蛋白染色阳性,并发绿色荧光.结论:人脐带间充质干细胞移植至大鼠体内能够存活并分化为肝样细胞,人脐带间充质干细胞可能作为肝细胞移植的重要来源.     

视网膜血管内皮细胞的培养与纯化

目的:探讨人视网膜血管内皮细胞的体外分离和选择性培养方法。方法:将人视网膜通过剪碎、匀浆、过筛、胶原酶消化处理后,结合密度梯度离心和物理刮除等分离方法获得较纯的视网膜血管内皮细胞,接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中,并采用含内皮细胞生长因子和肝素的培养基促进内皮细胞贴壁生长,观察细胞生长状况,并应用免疫组化方法进行鉴定。结果:培养的细胞成典型的铺路石样生长,Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性,细胞纯度达98%以上。结论:本实验方法简单易行,培养出的人视网膜血管内皮细胞纯度高、生长状态良好,并可稳定传代,为视网膜血管疾病的基础研究提供有效的模型建立方法。     

肝细胞原代培养研究综述

对国内外肝细胞培养研究作出综述.首先介绍了分离肝细胞的各种方法及各自的优缺点, 重点对各种酶分离技术进行了比较.其次阐述了肝细胞的纯化方法和生物学性状检测,最后综述了 影响肝细胞体外培养的因素.