pACT E3质粒的构建及其在转基因烟草中的表达

将1个从棉花中分离的新的启动子ACT E3插入质粒pBI101,ACT E3与GUS基因融合，构建成pACT E3表达载体。通过农杆菌介导转化法将ACT E3/GUS融合基因导入烟草。GUS组织化学染色分析表明，在ACT E3启动子控制下，GUS基因仅在叶片及茎等组织中特异表达。     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A(ChsA)的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

不同长度马铃薯GBSS基因启动子的块茎专一性表达的初报

将０．４,０．８,１．６,２．９ｋｂＧＢＳＳ基因的５’侧翼区与ＧＵＳ基因融合,构建了双元表达载体。０．８ｋｇＧＢＳＳ－ＧＵＳ通过基因枪转化法在块茎切片中获得了瞬间表达。     

利用双启动子质粒在毕赤酵母中高效表达人FGF1

基于p PIC9K构建了同时含有AOX1和FLD1的双启动子质粒,并成功转入毕赤酵母GS115中,建立了一个新型的全长人活性FGF1表达系统。测序结果和SDS-PAGE显示质粒构建成功,两种启动子可同时被甲醇诱导。液质联用分析表明,目的蛋白的氨基酸组成与人源性FGF1基本一致,且在生物活性测定中表现出良好的生物相容性。经过大规模发酵与凝胶过滤层析,重组FGF1蛋白的产量为197 mg/L,约为当前报道的最高表达水平的两倍,且纯度达到97%。     

大豆微粒体油酸盐脱饱和酶FAD2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从大豆种子中提取RNA,通过逆转录PCR的方法扩增出1307bp的大豆微粒体油酸盐脱饱和酶FAD2基因,并将其克隆到pMD18-T vector,DNA测序分析表明克隆的片段与原序列相似性达到99.9%,蛋白质相似性达到100%,显示其与同科植物花生同源性最高,与其它植物FAD2的氨基酸序列同源性较低.实验室前期从锦橙中克隆了种子球蛋白基因启动子ssp,转化烟草证明具有种子特异性调控表达的特性.本研究利用ssp启动子和大豆的FAD2基因构建了在种子专一性启动子驱动下的植物表达载体p3300-ssp-FAD2-Tons,为进一步进行油料作物的脂肪酸基因工程奠定了基础.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒PY-α的构建

利用分子生物学方法，以含人结核杆菌热休克蛋白（HSP）70基因全长序列的质粒pMT-70为模板，扩增出hsp70启动子，将其定向克隆于pUC-19，构建成重组质粒pY6013；然后以重组质粒pIJK-1为模板，扩增出分枝杆菌α信号肽基因并将其克隆到pY6013闰中hsp70启动子的下游，得到了大肠杆菌－分枝杆菌表达质粒pY-α。     

含有肌球蛋白重链启动子的p-EGFP1质粒的构建

从前列腺组织中提取总DNA，以其为模板经PCR扩增得到肌球蛋白启动子，将扩增片段和处理好的p—EGFP1载体相连，连接产物转入到大肠杆菌HB101中，经筛选得到连有myosin启动子的p—EGFP1重组质粒．用酶切和PCR的方法对重组质粒进行鉴定．成功构建的质粒可用于前列腺平滑肌细胞和成纤维细胞的分离，这将对于阐明前列腺基质增生的机理起到重要作用．     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

穿俊质粒pGFP—1与CMV启动子重组体的构建

构建并筛选出能在哺乳细胞表达的重组质粒。方法：以含ＧＦＰｃＤＮＡ报告者基因的穿梭质粒ｐＧＦＰ－１ｏ ｆａ ｗｓｇ ，ｔｆｑｐｅｔ ｗ ａｎｄ ｘｌｅｑｕｇｇｘｙｎｋ ｆｃｌ ｂｂ ，ｅｓ ｅｔ ａｄｌｄｔｇｊ ｘｅｇ ｒｆｓｙｓｑ ｖｆｈｐｔｇｊ ｘｅｇ ｒｆｍ ｏｕｇ     

CTLA4Ig真核表达质粒及穿梭质粒的构建

以表达人CTLA4Ig(hCTLA4Ig)的原核质粒为基础,采用限制性DNA内切酶,DNA连接酶等基因重组技术,构建了能表达该蛋白的真核质粒,ELISA法检出了受转染的真核细胞培养上清液中的蛋白表达.在此基础上构建了含hCTLA4Ig的穿梭质粒.     

通过瞬间表达测定植物花药花粉特异基因启动子的时空表达式

通过瞬间表达快速测定了ＴＡ２９和Ｚｍ１３启动子在一些植物中的时空表达性，结果表明，ＴＡ２９启动子在烟草和番茄的花药中具有地空表达性，而Ｚｍ１３启动子在油菜花粉中无任何表达，这为一些植物构建或转化不育和恢复基因提供了理论依据。     

CMV启动子克隆及其在植物体内的表达

根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.     

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.     

含PRPL,Ptac双启动子表达载体的构建

报道了一个新的含ＰＲＰＬ，Ｐｔａｃ双启动了的大肠杆菌表达载体ｐＮＪ的构建．在ＰＲＰＬ，Ｐｔａｃ分别或共同启动下，报告基因人肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）基因获得了较好的表达．双启动共同启动时的表达水平为两启动子分别启动时的表达水平之和．     

人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达

将带有哺乳动物细胞信号肽的人白细胞介素-6(hIL-6)基因片段构建到大肠杆茵-酵母细胞穿梭型质粒pYES2中，获得表达质粒pYES2-hIL-6。另外，将表达质粒pYES2-hIL-6转化到酿酒酵母细胞DBY747中，并将获得的转化子在含2％乳糖的YP培养基中培养到OD600=1．0左右，后用2％的半乳糖进行了诱导表达。结果发现，在培养上清中发现人白介素-6的分泌。     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

启动子对外源基因在转基因植物中表达的影响

将来自ｐＢＩ１２１质粒的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子片段插入到ｐＢＩ１２１的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与ＧＵＳ基因之间，构建了串联的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子载体ｐＬＢ３８．通过三亲交配，将ｐＢＩ１２１及ｐＬＢ３８分别转移到含ｐＧｖ３８５０的农杆菌中，成为适合本研究的双元载体。以叶圆盘转化法将外源基因转入烟草，获得了２种转基因植株。经ＤＮＡ分子杂交、ＮＰＴⅡ点分析、ＧＵＳ荧光定性及定量分析，证明外源基因已整合进烟草基因组并获得表达。ｐＬＢ３８的ＧＵＳ表达量为ｎＢｌ１２１的３～４倍，这表明启动子数目的不同会直接影响其启动基因的表达水平。     

大肠杆菌—分枝杆菌启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建

报道了大肠杆菌－分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３的构建过程。证明其保留了在大肠杆菌和分枝杆菌之间的穿梭功能，并具有启动子筛选功能。利用构建的ＰＥＱ３质粒，从卡介苗染色体中筛选出了具启动子活力的ＤＮＡ片段。     

杨树木质部特异性定位表达4CL1启动子的结构与表达特性

4-香豆素COA连接酶(4CL1)是木质素代谢途径中的一个关键酶,对该基因启动子的表达特性与调控元件进行了研究:首先,对毛白杨4CL1启动子进行了生物信息学分析,结果表明该启动子包括3个顺式作用元件,box P(CCTTCACCAACCCCC),box A(CCGTTC),box L(TCTCACCAACC),这3个顺式作用元件在已知的木质素代谢途径相关酶系如苯丙氨合成酶(PAI)和4CL中普遍存在;其次,运用PCR方法对该启动子进行了剪切,获得一个长393 bp的启动子片断,该启动子片断包括以上3个顺式作用元件;最后,将该启动子片段与GUS报告基因构建了植物表达载体并转化烟草,成功获得转基因再生苗,结果发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性.研究结果表明,一个393 bp长度的4CL1启动子片断足以介导外源基因在木质部特异性定位表达.