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相似文献
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1.
从Eisenia fetida中提取总RNA,利用P-Ⅲ组分序列两端的保守性设计引物,通过RT-PCR获得P-Ⅲ组分基因,并构建该组分质粒(pUC18)文库,经PCR筛选后进行序列测定及分析。在原已获得的Efp-Ⅲ-1和Efp-Ⅲ-3的基础上,利用中间引物从文库中筛选到Efp-Ⅲ-2基因。序列分析表明,该基因编码序列为720bp,编码239个氨基酸,与GenBank报道的Efp-Ⅲ-2五条序列整体相似性高达99.02%。通过序列比对,发现Efp-Ⅲ-1、2和3具有完全相同的结构域,差异位点零星分布在序列中间本文首次由一个实验室获得P-Ⅲ组分的三个亚组序列,序列比对分析证明它们是蚯蚓体内P-Ⅲ组分基因多态性的表现。  相似文献   

2.
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离   总被引:1,自引:0,他引:1  
以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%~99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.  相似文献   

3.
黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析   总被引:3,自引:1,他引:2  
从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因(AmCHS)cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.  相似文献   

4.
从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因(AmCHS)cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸。其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS 具有的活性位点和催化位点等保守性位点.  相似文献   

5.
促生长激素释放激素(GHRH)是一种重要的内分泌激素,主要功能是调节脑垂体分泌生长激素(OH).实验旨在克隆分析南方鲇GHRH基因的cDNA序列.从南方鲇的脑组织中提取总RNA并反转录成cDNA,再根据已知GHRH基因的保守区域序列设计引物,通过反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)实验,获得了一条334bp的片段并进行了测序,序列信息分析表明,该序列与沟鲇的GHRH基因同源,相似性达99%.根据同源性检索结果推测该序列编码110个氨基酸,并基于该编码序列分析了南方鲇GHRH的功能结构域以及南方鲇同其他物种的遗传发生关系,  相似文献   

6.
根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。  相似文献   

7.
根据甘蓝型油菜S-GT(thiohydroximate S-glucosyltransferase)基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增.获得S-GT基因全长.克隆的海甘蓝S-GT序列与甘蓝型油菜序列相比,除74 bp的内含子部分外有92个碱基的差别,相似性高达93.4%.分析显示该序列均有完整的开放阅读框,并表明所克隆的海甘蓝S-GT序列编码465个氨基酸,在第10个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸(A),总共有23个氨基酸不同,相似性为95.06%.根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了海甘蓝S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体,为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础.  相似文献   

8.
本报道对一个衰老下调基因的鉴定.从绿色和正在衰老的紫萍叶状体组织中分别提取总RNA,然后使用一个oligo—dT引物进行逆转录合成cDNA.cDNA用oligo—dT和简并引物进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳.电泳后发现,一条cDNA带存在于由绿色组织而不存在于由正在衰老的组织所得到的样品中.将这一cDNA回收,克隆进T—vector并且进行了测序.Northern blot分析表明,该cDNA对应基因的表达受衰老调节而减少.根据第一个cDNA序列设计了一个特异性引物,进行RT-PCR扩增,并且克隆到另外一个部分cDNA.测序结果表明,第二个克隆具有与第一个cDNA相重叠的40bp的片段.将第一个cDNA序列与删去40bp重叠区的第二个cDNA序列连接,我们得到一个322个核苷酸的cDNA3'端部分序列.用BLASTN程序将该序列翻译后与NCBI non—redundant database中已知的蛋白进行比较,结果表明所克隆的cDNA代表的基因与光呼吸途径的丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶编码基因有很高的相似性.  相似文献   

9.
参照Kajiwara等人获得的β-胡萝卜素酮化酶cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶cDNA的完整编码片段并进行了序列测定与分析.结果表明,所获得cDNA序列与Kajiwara等人报道序列具有96.4%的相似性,蛋白序列具有98.3%的相似性,说明所获得的cDNA序列确为β-胡萝卜素酮化酶的cDNA序列.  相似文献   

10.
采用RLM-RACE法,根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列,设计2条特异性嵌套PCR引物,成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列,测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸,编码N端202个氨基酸,Blast P结果表明,该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85%以上,同时找出了其转录起始位点,即为该序列的第1个碱基g.  相似文献   

11.
用DNA合成仪合成了分别带有PstI位点和SalI位点及终止密码子的2个用于扩增hIGF-1cDNA的PCR引物.利用合成的引物,700bp长的hIGF-1cDNA模板和Taq聚合酶进行PCR扩增.扩增产物经电泳鉴定后克隆进M13mp18载体,进行核苷酸序列分析.结果显示:PCR产物含已发表的hIGF-1成熟蛋白的编码序列和5'端的PStI位点及3'端的SaiI位点及终止密码TAG.用加端PCR技术成功地扩增和改造了hIGF-1的编码序列.  相似文献   

12.
Earthworm fibrinolytic enzyme component A(EFEa),a protein with dual fibrinolytic activity ,is one of the major therapeutically important earthworm fibrinoltic enzyme components .The cDNA fragment encoded the mature protein was cloned from earthworm (Eisenia fetida )by the RT-PCR technique,The deduced amino acid sequence of the EFE component A show high homology with some members of serine proteases trypsin family,and the amino acid residues constituting the active sites are conserved in the EFEa as compared with the other proteins of the trypsin family ,The cDNA fragment was subcloned into the expression vector pQE31 and pMAL-c2X of E.coli.The resulting expression plasmids,pQE-efea and pMAL-efea ,were used to transform the E.coli strain M15.Recombinant protein bands corresponding with calcuated molecular witht were induced .The induced His6-EFEa fusion protein with pQE-efea was accumulated into inclusion body ,while the induced MBP-EFEa fusion protein with pMAL-efea was soluble and showed fibrinoloytic activities.  相似文献   

13.
扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D(260)/D(280)值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带。根据扩展青霉所产碱性脂肪酶(Lip PE)N末端20个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3‘端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT-PCR技术和3‘-RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3‘非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用Clot Tech公司的SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,所表达的GST-Lip EP融合蛋白分子质量约为53ku;免疫印迹(Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC20718脂肪酶的基因。  相似文献   

14.
转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯的研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
采用RT—PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了490bp的人铜锌超氧化物歧化酶(hCM,Zn—SOD)基因的cDNA序列,进行了序列测定,结果和文献报道的一致;构建了CaMv35S启动子驱动hCu,Zn—SOD基因的植物表达载体PBICuSOD;用三亲交配法将重组质粒PBICuSOD转化到农杆菌LBA4404,转化马铃薯得到转基因植株。PCR和Southern—blot分析证明,hCu,Zn—SOD基因巳整合到马铃薯基因组中。Western blot分析表明,hCu,Zn—SOD基因在转基因马铃薯植株中得到表达。用NBT光还原法测定转基因马铃薯植株中的SOD酶活力,叶的总酶活为1066.6U/g(湿重,下同),块茎的总酶活为10llU/g。  相似文献   

15.
一种新细胞因子基因真核表达载体的构建和鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
采用PCR方法,以人胎盘cDNA文库为模板,扩增出人B淋巴细胞刺激因子(hBLys),经克隆测序及纯化后,再以此PCR产物为模板,用Nest-PCR方法进一步扩增得到B淋巴细胞刺激因子的胞膜外功能区域(hsBLyS)的DNA片段,纯化、克隆测定鉴定后,扩增并纯化粒,经酶切、纯化后克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构成真核表达载体pcDNA3.1(+)/hsBLyS。结果表明:用此方法制备得到的hsBLyS的DNA片段经测序鉴定与文献报道相符,构建的真核表达载体经鉴定也达到了预计的结果。  相似文献   

16.
一个新的水稻GST类似蛋白基因XIG的克隆与分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
根据编码一种玉米GST类似蛋白的mRNA In2-1序列设计引物,以水稻cDNA文库为模板,PCR扩增得到一条270bp的DNA片段,以此片段为探针分别筛选水稻根cDNA文库及水稻基因文库,获得一条全长cDNA及其相应的全长基因,并通过测序得到了两者的全序列,该基因编码的蛋白具有GST的典型特征,在水稻中尚未见报道。  相似文献   

17.
以甘蓝(Brassiaca oleracea)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,以cDNA第一链为模板,通过PCR扩增,获得甘蓝磷酯酶D(Phosphorate Lipid Dehydrolase,PLD)HKD2功能区的基因片段.对其进行Blast分析,结果表明,分离的目的片段核苷酸序列与Genbank中报道的甘蓝PLD基因相比同源率为99.7%,只有2个碱基发生改变.将得到的PLD基因片段插入植物表达载体pAT940,构建了PLD基因反义表达载体pATC—rPLD,为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础.  相似文献   

18.
目的通过RT-PCR扩增广西巴马小型猪Myostatin cDNA序列,经过连接、转化、克隆测序后,与NCBI中发表的猪Myostatin序列进行同源性比较,分析广西巴马小型猪Myostatin的cDNA序列结构特点及与其他物种间的聚类关系,为日后构建Myostatin高效表达载体及进一步研究Myostatin对广西巴马小型猪肌肉生长的影响奠定基础。方法以广西巴马小型猪的肌肉组织总RNA为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),利用合成的特异性引物,扩增得到巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA的全序列。该扩增片段经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增,经一系列鉴定后,测序。结果本实验克隆到巴马小型猪Myostatin基因cDNA序列长度为1128 bp,与GenBank报道的猪Myostatin基因cDNA序列同源性高达99.7%,与人、奶牛、家鼠等物种的cDNA序列间同源性可达到92.3%以上,证明Myostatin基因具有较高的保守性。同时发现广西巴马小型Myostatin基因cDNA序列有三处存在碱基突变,两个为同义突变,一个为错义突变。  相似文献   

19.
为了获取全长的小分子G-蛋白Rab3a,以用于研究Rab3a与其他蛋白相互作用关系,本实验以人胎盘总cDNA为模板,PCR扩增到人Rab3a cDNA全编码区。产物回收后克隆于质粒pYESTrp2的BamHI/XhoI位点,测序结果表明,本实验获得的Rab3a cDNA包含了起始和终止密码子。与PCR引物设计的参照Rab3a比较有5个核苷酸变异,与翻译的氨基酸序列完全一致。由此表明本实验获得的Rab3a cDNA可用于进一步研究。  相似文献   

20.
Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIP) play important roles in plant defense of pathogen, especially fungi. A pair of degenerated primers is designed based on the conserved sequence of 20 other known pgip genes and used to amplify Gossypium barbadense cultivation 7124 cDNA library by touch-down PCR. A 561 bp internal fragment of the pgip gene is obtained and used to design the primers for rapid amplification of cDNA ends. A composite pgip gene sequence is constructed from the products of 5′ and 3′ RACE, which are 666 bp and 906 bp respectively. Analysis of nucleic acid sequence shows 69.2% and 68.7% similarity to Citrus and Poncirus pgip genes, respectively. Its open reading frame of the gene encodes a polypeptide of 330 amino acids, in which 10 leucine-rich repeats arrange tandemly. A new set of primers is designed to the 5′ and 3′ ends of the gene, which allows amplification of the full-length gene from the cotton cDNA library. Genomic DNA analysis reveals that this gene has no intron.  相似文献   

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