麻疯树JcCBF3基因的克隆及其抗寒功能初探

从麻疯树中克隆到一个CBF3基因,命名为JcCBF3,ORF全长678bp,编码225个氨基酸;氨基酸序列同源性比对结果显示JcCBF3与其他物种CBF序列具有较高的同源性,与木薯和橡胶树的相似度最高,达到79%和74%.RT-qPCR结果表明低温胁迫12h后JcCBF3基因的表达量达到峰值,为对照的62倍.将JcCBF3构建到植物过表达载体pBI121上并成功转化烟草.低温处理下转基因烟草幼苗的游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的增幅均大于野生型烟草,并且JcCBF3基因的过表达增强了含有CRT/DRE元件的下游抗性基因的表达.     

抗HTNV单抗1A8鼠/人嵌合Fab抗体植物表达载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8VLCκ基因或1A8Fd基因的重组质粒中扩增出1A8VLCκ基因及1A8Fd基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点,将其克隆入植物表达载体pCAMBIA2301或pBIl21,构建1A8VLKCκ-pCAMBIA2301和1A8Fd-pBI121。用PCR方法改造酶切位点,继而将含有1A8Fd基因的植物表达框克隆入1A8VLCκ-pCAMBIA2301,构建获得1A8Fab-pCAMBIA2301重组质粒,并导入农杆菌GV3101。为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

拟南芥AtSuc3和AtSuc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建

蔗糖转运蛋白在调节同化产物的分配过程中起重要作用。为了分析拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSuc3、At-Suc4的功能和协同作用,以哥伦比亚型拟南芥为材料,通过RT-PCR技术克隆了蔗糖转运蛋白基因(sucrose/H+cotransporters,SUCs)AtSuc3和AtSuc4的cDNA,利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子,构建了含有含有AtSuc3和AtSuc4 cDNA的单价植物表达载体pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和双价植物表达载体pBI2301-q3-s3-q4-s4,为进一步分析该植物表达载体在调控库源关系中的作用以及在经济作物中的应用奠定基础。     

外源基因转化烟草悬浮细胞方法的改进

烟草悬浮培养细胞作为一种重要的实验材料已有较多的研究,将外源基因通过克隆进行载体构建,转化入悬浮培养的烟草细胞并进行表达,在带有相应筛选抗性的抗生素固体培养基中进行培养,再将愈伤组织转入液体培养基中进行培养,得到转入外源基因的液体悬浮培养烟草细胞.我们通过对此法作一些改进,使其便于操作、省时,适合在一般实验室条件下进行操作,且烟草悬浮培养细胞传代培养快,取材方便的特性对实验的开展也有很大的促进.     

表达长喙田菁SrPCS4烟草的获得及Cd抗性研究

植物螯合肽(phytochelatins,PCs)在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用,是以谷胱甘肽为底物,在植物螯肽合成酶(phytochelatin synthase,PCS)催化下合成的.作者已经克隆得到的长喙田菁(Sesba-nia rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS4 cDNA长为1035 bp,其ORF编码177个氨基酸,以pHANNIBAL及pART27为基础,构建了CaMV35S启动子驱动的SrPCS4基因植物表达载体pAM25,采用电击转化方法将pAM25导入根癌农杆菌EHA105,并通过改良叶盘转化方法用该菌株对烟草进行了转化,对转基因烟草进行了PCR与northern-blot检测,研究结果表明得到了表达该基因的烟草,但表达该基因的烟草不能够提高对Cd的抗性.     

高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响

为分析高山离子芥CbPLDβ基因的抗寒性价值,本实验构建了高山离子芥CbPLDβ的表达载体PBI121-CbPLDβ并转化烟草,经过筛选及PCR测序鉴定,获得转基因烟草植株.通过低温胁迫实验,分析了转基因烟草的抗寒性,结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,在低温胁迫下转基因烟草植株的电解质渗透率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均高于野生型烟草,说明CbPLDβ基因提高了烟草抵抗低温的能力.     

番茄Pti基因瞬时表达与互作检测

丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白。文章通过克隆番茄Pti(Pto interaction protein)基因Pti4、Pti5和Pti6,分别构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和western blotting检测,并进一步利用免疫共沉淀技术,在植物体系中检测了它们与番茄Pto蛋白的相互作用。实验结果表明,利用所构建Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体,在烟草中获得了预期大小Pti4、Pti5和Pti6蛋白,并在植物体系中验证了它们与Pto蛋白的相互作用。该工作为深入研究Pti基因在番茄分子免疫途径的功能奠定了基础。     

天山雪莲△~9硬脂酰脱饱和酶基因信号肽的功能分析

为了验证天山雪莲△9硬脂酰脱饱和酶基因sikSAD信号肽的功能,本研究利用PCR法从已构建的天山雪莲cDNA文库中克隆了sikSAD的96bp信号肽序列,将其与报告基因GFP连接,成功构建了融合基因植物表达载体pCMBIA2301-sp-GFP。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。通过激光共聚焦显微镜观察GFP在转基因烟草叶片中的激发荧光,确定天山雪莲△9硬脂酰脱饱和酶sikSAD定位于天山雪莲的叶绿体中。     

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.