红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

gpd1基因莱茵衣藻表达载体构建及农杆菌介导转化莱茵衣藻

甘油3-磷酸酰基转移酶基因(gpd1)可以调控植物脂质代谢中关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的活性,能促进植物脂质合成。本研究以莱茵衣藻FACHB-479为受体,通过克隆酵母gpd1基因,构建莱茵衣藻的农杆菌双元表达载体pRI-Ble-GPD1,首次以农杆菌介导法将携带在农杆菌LBA4404的gpd1基因转移到FACHB-479基因组。在含有10μg/m L博莱霉素的TAP平板筛选得到抗性藻体细胞。经过分子生物学PCR及RTPCR鉴定,获得转基因藻FACHB-GPD。尼罗红染色法鉴定分析FACHB-GPD细胞中油脂含量增高1.3~1.52倍。该研究表明农杆菌介导外源gpd1基因在莱茵衣藻FACHB-479基因组的过表达能增加脂肪酸含量,从而提高其产油能力。     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

山桐子IpSAD基因家族分析及功能鉴定

【目的】硬脂酰-ACP Δ⁹脱氢酶(stearoyl-ACP Δ⁹ desaturase,SAD)是决定脂肪酸组成的关键酶,分离和鉴定木本油料植物山桐子(Idesia polycarpa)的SAD基因,可为遗传改良山桐子油的脂肪酸组成提供基因资源。【方法】 使用 HMM 和 Blastp 鉴定山桐子全基因组中的SAD家族成员;利用MEGA X、MEME和PlantCare等在线软件对其蛋白质理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和启动子顺式调控元件等进行分析;使用MCSCANX分析山桐子和毛果杨SAD基因之间的共线性关系;基于RNA-seq数据,分析IpSAD各成员的表达模式,通过病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)快速验证它们的生物学功能。【结果】 ①在山桐子基因组中共鉴定到7个IpSAD基因(IpSAD1~7),多重序列比对结果显示各成员间序列相似度较高且结构域保守;②系统发育分析表明,IpSAD成员可以分为3个亚组,与拟南芥SAD家族的分类结果一致,拟南芥单不饱和油酸合成关键基因AtSSI2与山桐子IpSAD2、IpSAD3、IpSAD4的亲缘关系较近;③启动子区域顺势调控元件预测结果显示IpSAD基因的启动子含有光反应、脱落酸响应等顺式调控元件;④IpSAD基因按其组织表达模式可分为3类,第1类和第2类成员在大部分组织中表达量较低,而第3类成员在所有组织中表达量均较高。⑤沉默IpSAD基因使叶片的油酸含量显著降低,其中IpSAD3的沉默可使油酸含量下降76%。【结论】 明确了IpSAD家族各成员的基本特征,确定了它们对于油酸合成的生物学功能,并为山桐子油脂生物合成调控机制研究奠定了基础。     

大豆磷脂对小鼠红细胞膜和脑组织中脂肪酸含量的影响

采用高效液相色谱法研究了小鼠灌胃大豆磷脂乳液(剂量为w(大豆磷脂/体质量)=2.5、5.0、10.0 g/kg)30 d对小鼠红细胞膜和脑组织中脂肪酸含量的影响.结果表明:(1)w(大豆磷脂/体质量)=10.0 g/kg剂量组小鼠红细胞膜和脑组织中亚油酸、亚麻酸的含量及多不饱和脂肪酸(PUFA)占总脂肪酸(TFA)的比例显著增加(P＜0.05),红细胞膜中油酸的含量显著下降(P＜0.05);(2)w(大豆磷脂/体质量)=5.0 g/kg剂量组小鼠红细胞膜中亚油酸、亚麻酸的含量和w(PUFA/TFA),以及脑组织中亚油酸的含量显著提高(P＜0.05);(3)w(大豆磷脂/体质量)=2.5 g/kg剂量组小鼠红细胞膜和脑组织中各所测脂肪酸的含量无显著差异.说明大豆磷脂可增加小鼠红细胞膜和脑组织中亚油酸、亚麻酸等的含量,改善两者的脂肪酸组成,但两者的变化存在差异.     

桑叶中脂肪酸的GC-MS分析

用正己烷提取桑叶中的脂肪酸,经皂化、酯交换法处理后,气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析和鉴定脂肪酸的化学成分。结果是,共分离出24种化合物,鉴定了其中的19种脂肪酸,占脂肪酸总含量的93．18％。桑叶中脂肪酸的成分以棕榈酸(26．87％)、亚麻酸(22．99％)、亚油酸(13．40％)、硬脂酸(6．99％)、油酸(3．17％)、花生酸(3．43％)、棕榈油酸(3．05％)、山萮酸(2．93％)、蜡酸(1．63％)等为主。     

利用TRV过表达和沉默系统验证植物油脂合成相关基因的功能

为探究烟草脆裂病毒过表达和沉默系统进行油脂相关基因研究的可能性,该研究克隆了拟南芥的WRI1和FAD2基因,分别构建了TRV过表达和沉默载体. 利用瞬时侵染技术侵染本氏烟草,取材料进行RT-PCR和脂肪酸含量检测. 结果显示在过表达WRI1基因的本氏烟草中,侵染叶和非侵染叶的WRI1基因及其相关参与脂肪酸合成基因ACP1、KAS1和BCCP2等都有明显上调,且脂肪酸含量检测结果显示分别增加16%和28%. 在沉默FDA2基因的本氏烟草植株中,发现多不饱和脂肪酸含量分别减少约25%和24%. 因此,利用TRV系统对油脂相关基因进行研究是可能的.     

高渗透水泥浆高温高压流变性研究

随着油气开采难度的增大,对固井质量和固井水泥浆添加剂的要求越来越高,需要研制开发出新型高渗透水泥浆体系。借助美国产Fann50流变仪,研究了温度和压力对高渗透水泥浆流变性的影响,并与常规水泥浆进行了对比。分析结果表明,一定压力下,高渗透水泥浆的动切力、表观粘度随温度的升高而逐渐降低,流性指数减小;一定温度下,压力对高渗透水泥浆体系流变参数的影响不如温度明显。高渗透水泥浆比常规水泥浆体系具有更好的热稳定性。运用宾汉、幂律、卡森、赫切尔巴尔克莱(H B)、带剪切稀释系数等5种模式对实验数据进行了拟合分析,结果表明,H B模式是描述高渗透水泥浆高温高压流变性的最佳模式。     

高渗透水泥浆高温高压流变性研究

随着油气开采难度的增大，对固井质量和固井水泥浆添加剂的要求越来越高，需要研制开发出新型高渗透水泥浆体系。借助美国产Fann50流变仪，研究了温度和压力对高渗透水泥浆流变性的影响，并与常规水泥浆进行了对比。分析结果表明，一定压力下，高渗透水泥浆的动切力、表观粘度随温度的升高而逐渐降低，流性指数减小；一定温度下，压力对高渗透水泥浆体系流变参数的影响不如温度明显：高渗透水泥浆比常规水泥浆体系具有更好的热稳定性。运用宾汉、幂律、卡森、赫切尔-巴尔克莱(H-B)、带剪切稀释系数等5种模式对实验数据进行了拟合分析，结果表明，H-B模式是描述高渗透水泥浆高温高压流变性的最佳模式。     

C60高强高性能混凝土的配制

通过选择适宜的配合比与高效减水剂,采用合理的搅拌与成型工艺,依靠优选当地易得的原材料可以配制出C60级的高强高性能混凝土。     

高温作用对高强混凝土渗透性能的影响

研究了高温作用对高强混凝土(HSC)及含PP纤维的高强混凝土渗透性能的影响,探讨了表征渗透性的湿迁移渗透系数、相对氯离子渗透系数及空气渗透系数之间的关系以及渗透性与爆裂的关系.研究表明,HSC遭受500℃的高温后,湿迁移渗透系数、相对氯离子渗透系数及空气渗透系数都大幅度增加,PP纤维可以有效地缓解高温后高强混凝土渗透性的劣化,3种渗透系数之间具有较好的相关性,HSC高温后的渗透性能与爆裂性能有一定的对应关系,HSC具有一个临界爆裂渗透系数.     

采用H.S.B菌液处理高浓度焦化废水的工艺研究

研究了将O-A-O处理工艺和活性炭H.S.B菌种生物处理法相结合的处理高浓度焦化废水的新工艺,该工艺利用该菌种中的好氧菌、厌氧菌在曝气和厌氧工艺阶段中发挥的不同作用使废水得到处理。结果表明,COD为7440mg/L的焦化废水经过6h的初次曝气SBR工艺处理后,废水的COD去除率可达到47％。24h的厌氧SBR工艺处理后废水的COD去除率为78％。最后经过32h的二次曝气SBR工艺处理后,最终出水的COD为492mg/L,总的去除率达到94％。该工艺具有运行成本低和COD去除率高的特点。     

浅析豫南粳稻优质高产栽培策略

产量低、病虫害重、品质下降是豫南粳稻难以发展的直接原因.将粳稻置于高温、高湿的生态条件下栽培是其病虫害重、产量低、品质下降的根本原因.解决上述问题的唯一途径是推迟灌浆成熟期,将成熟期由目前的9月上旬推迟到10月中旬.对信阳市48年主要气候因子统计结果表明,推迟粳稻成熟期,有利于改善粳稻生长发育的生态条件,并能保证安全成熟.     

MgO高温高压下的P-V-T关系

本文利用分子动力学方法和有效经验对势模型对MgO高温高压下的物态方程进行了研究,发现分子动力学方法得到的MgO岩盐结构的摩尔体积(温度范围:300-2000 K,压力范围:0～100 GPa)和实验结果吻合;另外,基于势模型的可靠性预测了300-2000K和0～100 GPa的温压范围内MgO岩盐结构的P-V-T关系,并对两种势模型计算结果进行了比较研究.计算得到的高温高压下MgO物态方程在地球物理学具有重要的参考价值.     

高气压高能放电小型低速风洞的研制

根据高能放电腔的特点以及放电对气体流量、流速和流场的要求,提出了应用于高气压强电离放电的小型低速风洞技术方案。该技术方案在满足流场、流速要求的前提下开展气动设计和结构设计,重点研究了总体结构、气流喷口和收集口的气动与结构设计、动力段气动与结构设计、流速调节控制、电机散热等关键技术。简要介绍了为某单位研制的应用于高能放电的小型风洞。现场应用表明,该小型风洞稳定可靠,是一种实用、有效的高气压高能放电气流循环装置。     

高钙固硫粉煤灰水热条件下元素的溶出机制

试验用比色法和原子吸收法等分析手段系统地研究了粉煤灰-H2O、粉煤灰-NaOH-H2O、粉煤灰-Ca(OH)2-H2O 3个系统在不同水热条件下Al、Sl、Ca元素溶出浓度。结果表明：温度、反应时间和OH^-的浓度是影响离子渗出的主要因素；计算了不同粉煤灰-Ca(OH)2-H2O系统在100℃、12h条件下SiO2的溶出率，高钙固硫粉煤灰中SiO2的溶出率高于普通粉煤灰，用SiO2的容出率可以表征粉煤灰的活性；粉煤灰与Ca(OH)2的水热反应，可能是一个原地化学反应。