小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.     

AK078438基因原核表达载体构建、多克隆抗体制备

AK078438基因是一个功能未知的新基因.通过RT-PCR方法扩增出AK078438基因的全长开放阅读框,构建了AK078438基因的原核表达载体.经诱导表达,亲和层析纯化该基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.ELISA和Western blot结果表明我们成功的制备了AK078438基因的抗体,为后续该基因功能的研究做好了准备.     

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^-1 IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni²⁺亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320 000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致...     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础.     

TMV重组外壳蛋白Sc1754CP的原核表达和多克隆抗体制备

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）重组外壳蛋白（coat protein,CP）Sc1754CP是一种能够激发敏感烟草产生过敏性反应（hypersensitive reaction, HR）的蛋白, 但是这种蛋白无法通过植物病毒的大量扩增获得.为了获得足够量的上述蛋白,并对这种蛋白在植物中激发的HR反应进行深入研究,作者在大肠杆菌中大量表达Sc1754CP蛋白,并且获得了Sc1754CP高度专一性的多克隆抗体.上述研究为进一步深入研究Sc1754CP及其激发的新的过敏性反应机制奠定了基础.     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

人NEDD8 原核表达及兔高免血清制备

摘要: 本研究根据基因比对,将合成的nedd8 基因( HN8) 酶切克隆入pCold-TF 原核表达载体中,命名为pCold-HN8,转化到感受态宿主菌BL21( DE3) 中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷( IPTG) 于16℃中诱导表达24 h,超声波裂解,通过His-bind 纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE 检测,结果HN8 蛋白获得可溶性表达,融合蛋白大小为64 kDa。用纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,经Western Blot 和间接免疫荧光试验证实,兔抗HN8 蛋白的血清能够特异性识别HN8 蛋白。这为进一步研究HN8 蛋白在Neddylation 通路中的修饰作用奠定了基础。     

关于分数(g,f)-2-覆盖图

设G是一个图,并设h是定义在图G的边集E(G)上的一个函数,使对任意的e∈E(G),有h(e)∈[0,1]。令dhG(x)= x瘕?h(e),则称dhG(x)是G中顶点x的分数度。若h满足对任意的x∈V(G),有g(x)≤dhG(x)≤f(x),则称h是G的一个分数(g,f)-因子。一个图称为分数(g,f)-2-覆盖图,如果对图G中的任何两条边e1和e2,G都有一个分数(g,f)-因子h满足h(e1)=1和h(e2)。本文给出了一个图是分数(g,f) 2 覆盖图的充分必要条件。     

德国小蠊致敏原Bla g 2的Glu 233突变的分子对接研究

为探讨Bla g 2的E233A突变对抗原抗体相互作用的影响,从RCSB数据库下载德国小蠊致敏原Bla g 2野生型及其单克隆抗体4C3的NMR结构,运用Swiss PDB Viewer将Bla g 2野生型(E233-93Q)构建为突变型(E233A-93Q)三维结构;并将Bla g 2野生型和突变型分别与其单克隆抗体4C3进行分子动力学模拟和蛋白-蛋白对接.结果表明:突变体E233A与单克隆抗体4C3结合能力下降,进而增加了与Ig E的结合力,可能加重过敏反应的发生.     

RBBP10蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及乳腺癌中的免疫组织化学研究

在E．coli M15中表达RBBP10蛋白,经纯化后制备兔抗人RBBP10多克隆抗体,以免疫组织化学法检测RBBP10在15例人乳腺癌组织、5例乳腺小叶增生组织及2例正常乳腺组织中的表达情况结果显示：乳腺癌组织中,癌巢部分呈深棕色,提示RBBP10高表达,癌旁组织未着色;在乳腺增生组织中RBBP10在增生的乳腺上皮细胞中有低水平表达,而在正常乳腺组织中没有检测到RBBP10表达;检测发现RBBP10蛋白弥散分布于乳腺腺上皮细胞．研究结果提示RBBP10可能在乳腺癌发生和乳腺小叶增生中起一定作用．     

抗丁草胺多克隆抗体的制备及应用

以牛血清白蛋白-丁草胺免疫抗原免疫家兔获得了抗丁草胺多克隆抗体,并建立了竞争酶联免疫吸附检测丁草胺(除草剂中的一种主要成分)分析方法。该方法的检测范围在1×10^-9～100×10^-9mg/mL之间,且和化学结构相似的甲草胺和乙草胺无交叉反应。该方法也可用于检测稻田水样中丁草胺的含量。     

关于一类(g,f)-2-覆盖图的研究

一个图G称为(g,f)-2-覆盖图,如果G的任何两条边都属于它的一个(g,f)-因子,得到了如下结论:(1)当g≤f时,一个二部图是(g,f)-2-覆盖图的一个充分必要条件;(2)当f(X)=f(Y)时,一个二部图是f-2-覆盖图的一个充分必要条件及其简单判别准则.     

半乳糖凝集素PPL13的表达纯化及免疫组织化学研究

在E．coli M15中表达纯化半乳糖凝集素PPL13(placenta protein lectin13)，制备兔抗人PPL13多克隆抗体。以免疫组织化学法检测PPL13在人胎盘及脐静脉的表达情况．结果显示PPL13分布在胎盘及脐静脉的内皮细胞中．提示PPL13可能与胎盘及脐静脉内皮细胞的功能相关．