mTOR抑制剂联合替莫唑胺治疗恶性胶质瘤

目的:研究mTOR抑制剂替西罗莫司(Temsirolimus)联合替莫唑胺(Temozolomide)对C6鼠胶质瘤增殖及侵袭的影响.方法:传代培养C6大鼠胶质瘤细胞,HE染色观察细胞形态的变化,MTT比色法检测药物对C6细胞的体外增殖抑制作用.原位注射法建立C6大鼠胶质瘤模型,10 d后分为替西罗莫司组、替莫唑胺组、联合药物组(替西罗莫司+替莫唑胺)及空白组,隔天给药7次,4周后断头法处死大鼠取脑,做肿瘤病理组织切片,计算肿瘤体积;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,检测与肿瘤侵袭性有关的MMP1(基质金属蛋白酶1)的表达.结果:联合药物组促进肿瘤细胞凋亡效果显著高于替莫唑胺组(P0.01).与空白组比较,替莫唑胺组移植瘤体积下降了33.5%(P0.05),移植瘤中MMPl表达为(++),移植瘤细胞凋亡率64.6%(P0.05);联合药物组移植瘤体积下降了55.2%(P0.05),移植瘤中MMPl表达阳性(+),细胞凋亡率84.0%(P0.05).结论:西罗莫司联合替莫唑胺用药能明显抑制C6大鼠胶质瘤细胞移植瘤生长,并降低与肿瘤侵袭能力有关的MMP1蛋白表达.     

沉默SEMA3A基因对胶质瘤细胞U251增殖和转移的影响

探讨了SEMA3A基因在恶性胶质瘤细胞U251迁移和侵袭能力中的作用, 及其用于胶质瘤临床治疗的可行性. 用特异识别SEMA3A基因的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)片段与真核表达载体pFH-GFP-L连接, 再与辅助质粒联用来包装慢病毒. 通过荧光显微镜观察感染胶质瘤细胞U251的感染效率. 通过实时定量PCR技术和Western-blot技术验证了U251细胞中SEMA3A基因的沉默效果. 通过MTT法、PI染色法和Transwell小室分别检测了U251细胞增殖、细胞周期和运动能力的变化. 结果表明, SEMA3A-shRNA慢病毒感染U251能有效下调SEMA3A基因的表达水平(P <0.01), 使U251细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力明显降低(P <0.05), 细胞大量阻滞在G2/M期, 并促进了细胞凋亡(P <0.05).     

α-caesalpin抑制CSPG4通路诱导胶质瘤细胞线粒体功能障碍引发凋亡的机制

胶质母细胞瘤对常规治疗耐受,寻找新的药理学靶点和有效的治疗剂,对治疗替莫唑胺抗性神经胶质瘤尤为重要。通过测定呋喃二烯酮类(α-caesalpin,α-CAE)对耐药型胶质瘤细胞的促凋亡作用和α-CAE对线粒体功能和凋亡通路的调控,研究α-CAE诱导替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞凋亡的药理学作用和分子信号通路。研究表明α-CAE能够抑制CSPG4-AKTERK1/2通路,上调IGFBP3表达,并且引起了线粒体凋亡蛋白AIF和Bax的活化以及Drp1的募集。研究结果揭示了靶向CSPG4通路治疗化疗抵抗性胶质瘤的可能。     

汉黄芩素对人神经胶质瘤细胞U251的凋亡诱导作用

研究汉黄芩素对人神经胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响,用不同浓度的汉黄芩素作用于U251细胞系,通过核染色观察形态变化,MTT检测细胞增殖抑制率,流式分析检测细胞的凋亡情况.结果显示,药物作用后的细胞,DAPI核染色呈致密浓染,并伴有凋亡小体的出现;MTT法测得U251细胞的增殖得到明显的抑制,抑制率随浓度和作用时间的增加而上升,其中作用24 h的IC50为145.87 μmol/L; Annexin V-FITC /PI流式细胞检测证实汉黄芩素确实可以诱导U251细胞凋亡,并有剂量依赖的性质;通过比色法证明在药物处理过的细胞中,凋亡标志性酶Caspase-3被激活,且活性随着药物浓度的升高而增强.研究表明,汉黄芩素能明显抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有抗神经胶质瘤的作用.     

miR-106b/miR-93降低了宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科癌症.顺铂是临床上最常用的化疗药物,治疗过程中引起的顺铂抗性会导致化疗失败.越来越多的报道证实miRNA介导了癌症对化疗药物的敏感性.尽管已经发现miR-106b/miR-93促进多种癌症的发生发展,但是miR-106b/miR-93在宫颈癌中的功能鲜为人知.本研究发现miR-106b/miR-93在宫颈癌组织以及宫颈癌细胞系的表达高于正常宫颈组织.在HPV(+)宫颈癌细胞系中,miR-106b/miR-93的表达水平与细胞系对顺铂敏感性的程度相关;高表达miR-106b/miR-93可以降低宫颈癌细胞系对顺铂的敏感性;反之,miR-106b/miR-93的干扰表达可以提高宫颈癌细胞系对顺铂的敏感性.此外,我们发现RAD1是miR-106b/miR-93共同调控的靶基因.研究结果提示了miR-106b/miR-93通过负调控RAD1降低了宫颈癌对顺铂化疗的敏感性.     

ER-α36在2种人胶质瘤细胞中的表达比较及与Tamoxifen抗药性关系初探

为了探讨新型雌激素受体ER‐α36在他莫西芬（Tamoxifen ,TAM ）抑制人胶质瘤细胞增殖中的作用,以人神经胶质瘤细胞系 U 87‐M G 和 U 251为实验材料,采用MTT、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹等方法,观察ER‐α36的表达水平以及与TAM 抗药性的关系．结果显示：（1）2种细胞中均有ER‐α36的表达,但U87‐MG细胞中ER‐α36的表达水平明显高于U251细胞（P＜0．01）;（2）Tam均对2种细胞增殖产生抑制作用,且呈剂量依赖性．但U87‐MG对Tam的抗药性强于U251．提示新型雌激素受体ER‐α36的表达水平可能影响神经胶质瘤对TAM 的抗性．     

三维适形放疗联合替莫唑胺在脑胶质瘤临床治疗中的安全性评价

目的:探讨三维适形放疗联合替莫唑胺在脑胶质瘤临床治疗中的疗效与安全性评价.方法:选取2011年1月~2015年7月期间入院就诊的64例患者作为本次的研究对象,按照入院就诊顺序随机均分为研究组与对照组各32例,所有患者术后2~3周实施三维适形放疗,研究组另联合采用替莫唑胺进行化疗,对两组患者的临床疗效、不良反应以及随访生存率进行对照比较.结果:两组患者治疗3个月后的总有效率分别为87.5%(28/32)、37.5%(12/32),数据比较差异具有统计学意义(P0.05);经随访出院后1年、2年、3年研究组存活率分别为81.25%(26/32)、59.38%(19/32)、34.38(11/32),对照组存活率分别为62.5%(20/32)、28.13%(9/32)、9.38%(3/32),中位存活时间为25个月与10个月,数据比较差异具有统计学意义(P0.05).结论:三维适形放疗结合替莫唑胺在脑胶质瘤临床治疗中的疗效显著,安全性较好,值得临床应用及推广.     

替莫唑胺酯纳米粒的制备及抗脑胶质瘤活性研究

制备并优化替莫唑胺辛酯纳米粒(TOE-NPs),对其进行体外表征及抗脑胶质瘤效果考察.采用Box-Behnken响应面法优化替莫唑胺辛酯纳米粒处方;对采用最优处方制备的纳米粒的粒径、包封率、载药量、体外药物释放特性等进行评价,以大鼠脑胶质瘤细胞(C6)为模型细胞考察抗胶质瘤效果.纳米粒最优处方为:有机相与水相体积比(1:3.3),聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)质量浓度8.80 mg/mL,理论载药量17.77%,所制备的替莫唑胺辛酯纳米粒粒径为136.2±3.4 nm,包封率为(93.29±1.93)%,120 h累计释放率为(88.13±2.39)%,MTT结果显示替莫唑胺辛酯纳米粒对C6细胞的生长抑制活性强于替莫唑胺纳米粒(IC_(50),28.16μmol/L和169.12μmol/L,P 0.01).所优选的纳米粒处方合理可行,替莫唑胺辛酯纳米粒有明显的缓释特性和较强的体外抗胶质瘤活性.     

钾通道阻断剂对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响

为了检测电压门控钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)、四乙胺(TEA)和ATP敏感钾通道阻断剂格列苯脲(Glibenclamide,Gli)对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响,选用人胶质瘤细胞系U87和U251,其中钾通道阻断剂4-AP、TEA及Gli处理作为实验组,未处理的作为对照组.采用划痕实验和Transwell小室法检测钾通道阻断剂对U87和U251细胞迁移和侵袭能力的影响; Western blot检测药物处理后细胞高迁移率蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表达水平.结果表明:5 mmol·L^-1的4-AP、40 mmol·L^-1的TEA及400 μmol·L^-1的Gli可以显著抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭,并降低HMGB1表达水平.电压门控钾通道和ATP敏感钾通道对胶质瘤细胞迁移和侵袭具有重要调控作用,3种钾通道阻断剂对胶质瘤细胞迁移和侵袭有不同程度的抑制作用,可能通过调控HMGB1相关通路实现.     

替莫唑胺治疗垂体肿瘤的现状及展望

替莫唑胺是一种口服的烷基化药物,主要用于恶性胶质瘤的治疗。最近的研究开始关注替莫唑胺在垂体腺瘤及恶性肿瘤中的治疗效果。替莫唑胺可以使DNA甲基化,起到抗肿瘤的作用。而MGMT是一种DNA修复酶,可以修复替莫唑胺引起的DNA烷化作用,对抗替莫唑胺的抗肿瘤作用。本篇拟综述替莫唑胺对垂体肿瘤的治疗,记录患者的肿瘤类型以及其对于治疗的反应,并将相关报道中的MGMT免疫表达与肿瘤对于替莫唑胺治疗反应进行比较分析。截至目前已有19例使用替莫唑胺治疗腺垂体肿瘤的报道,其中包括13例垂体腺瘤以及6例恶性肿瘤。13例垂体腺瘤中有10例对替莫唑胺治疗效果较好,2例治疗效果差的的肿瘤细胞MGMT高表达。而替莫唑胺对6例恶性肿瘤的疗效均较好,但其中只有3例患者有MGMT免疫表达的相关资料,但均为MGMT低表达。在2例垂体腺瘤中进行了替莫唑胺治疗前后的肿瘤细胞形态学研究,对替莫唑胺治疗有反应的肿瘤细胞可见凋亡、出血、纤维化以及神经元分化。而在无反应的肿瘤患者中,无相应变化。目前的研究结果表明替莫唑胺对于侵袭性垂体腺瘤及恶性肿瘤的治疗效果显著,尚无其不良反应的相关报道。有证据表明,MGMT的表达与肿瘤对于替莫唑胺的反应呈负相关,绝大部分的垂体腺瘤及恶性肿瘤均为MGMT低表达。     

HCMV感染对神经胶质瘤U251缝隙连接的影响

为探究人巨细胞病毒(HCMV)感染对恶性神经胶质瘤U251细胞通讯连接的影响。采用HCMV ADl69株(MOI=5)感染神经胶质瘤U251细胞,相差显微镜观察细胞的形态学变化;细胞划痕法检测HCMV感染对U251细胞的迁移能力的影响;Real-time PCR及Western-blot检测神经胶质瘤U251细胞经HCMV感染后缝隙连接基因及蛋白的表达。相差显微镜观察结果显示U251细胞经HCMV感染后逐渐变大变圆;细胞划痕法结果显示经HCMV感染的U251细胞的侵袭转移能力增强;Real-time PCR及Western-blot结果显示U251细胞经HCMV感染的时间越长,其缝隙连接基因及蛋白的表达量会越少(p0.05)。实验结果表明,神经胶质瘤U251细胞经HCMV感染后,缝隙连接蛋白表达有所差异。这些缝隙连接基因可能参与了人神经胶质瘤的发生,为肿瘤治疗方面提供了新的思路。     

GNL3对脑胶质瘤干细胞的调控研究

肿瘤干细胞是一小群特异的肿瘤细胞,被认为是肿瘤发生,耐药和复发的主要原因。GNL3(Guanine nucleotide-binding protein-like 3) 是MMR1/HSR1 GTP结合蛋白家族成员,在干细胞增殖中发挥重要作用。本实验室通过质谱筛选,发现GNL3蛋白在脑胶质瘤干细胞(Glioma stem cell,GSC)中特异性高表达。目前关于GNL3在脑胶质瘤干细胞中的功能及其作用机制未见文献报道。为了研究GNL3在GSC中的功能,我们利用慢病毒感染细胞体系,在GSC中应用3个不同的靶序列对GNL3基因的表达进行稳定干涉;利用Western Blot对GNL3的干涉效果进行检测。实验结果表明,在稳定敲低GNL3表达的GSC中,胶质瘤干细胞的细胞活力和肿瘤细胞球(Tumor sphere)的形成能力明显受到抑制,表明GNL3蛋白对GSC的增殖能力及自我更新能力具有重要调控,提示GNL3在胶质母细胞瘤的肿瘤发生过程中发挥一定作用。     

敲低GNL3抑制脑胶质瘤干细胞增殖和自我更新

肿瘤干细胞是一小群特异的肿瘤细胞,被认为是肿瘤发生,耐药和复发的主要原因。GNL3(guanine nucleotide-binding protein-like 3)是MMR1/HSR1 GTP结合蛋白家族成员,在干细胞增殖中发挥重要作用。实验室通过质谱筛选,发现GNL3蛋白在脑胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)中特异性高表达。目前关于GNL3在脑胶质瘤干细胞中的功能及其作用机制未见文献报道。为了研究GNL3在GSC中的功能,利用慢病毒感染细胞体系,在GSC中应用3个不同的靶序列对GNL3基因的表达进行稳定干涉;利用Western Blot对GNL3的干涉效果进行检测。实验结果表明,在稳定敲低GNL3表达的GSC中,胶质瘤干细胞的细胞活力和肿瘤细胞球(tumor sphere)的形成能力明显受到抑制,表明GNL3蛋白对GSC的增殖能力及自我更新能力具有重要调控,提示GNL3在胶质母细胞瘤的肿瘤发生过程中发挥一定作用。     

腺病毒介导的BmK CT基因抑制神经胶质瘤U251细胞迁移及诱导凋亡的研究

以腺病毒为载体介导东亚钳蝎氯离子通道神经毒素(BmK CT)感染人脑神经胶质瘤细胞株U251,研究其对细胞迁移及凋亡的影响,并探讨可能的作用机制.首先以含BmK CT基因的腺病毒Ad-BmK CT及对应的腺病毒空载体转染U251细胞筛选出最佳感染浓度,随后利用Boyden Chamber实验和划痕实验检测了BmK CT对U251细胞迁移能力的影响,MTT检测了细胞存活能力,用Annexin V-Cy5和PI双标记流式检测分析细胞凋亡情况,并通过Western-blot检测凋亡相关蛋白分析可能的凋亡机制.结果显示,U251细胞感染Ad-BmK CT 48h后,迁移能力受到明显抑制;细胞变圆漂浮,Western-blot检测发现细胞色素c开始释放,caspase-3表达上调.     

MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

目的 探讨miR-17调控胃癌细胞上皮间质转化的作用机制.方法 检测胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17的表达水平;分别将miR-17模拟物(抑制物)和TGFBR2过表达载体(siRNA)转染到SGC-7901胃癌细胞中,通过MTT法、流式细胞术、Transwell实验和Western blotting检测细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT标志蛋白表达;荧光素酶报告基因分析验证miR-17与TGFBR2的靶向关系.结果 胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17表达上调;过表达miR-17促进SGC-7901细胞增殖、侵袭,抑制凋亡;miR-17靶向TGFBR2的3'UTR;过表达TGFBR2抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭,促进凋亡;miR-17通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路促进SGC-7901细胞EMT.结论 miR-17靶向下调TGFBR2表达,激活PTEN/PDK/AKT信号通路,促进SGC-7901细胞EMT.体内研究结果证明miR-17促进肿瘤的生长.因此,miR-17可能是胃癌抗转移治疗的潜在策略.     

HCMV感染对下调ATF5的人胶质瘤U251细胞干性的影响

研究HCMV感染对下调ATF5的U251细胞干性标记物CD133的表达、细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。采用荧光定量PCR及Western-blot方法检测HCMV(MOI=1)感染的U251细胞IE、CD133基因及蛋白表达水平的变化,结果表明,随IE表达量的增加U251细胞中CD133表达量显著增加;成功构建沉默ATF5细胞系siATF5-U251,HCMV感染siATF5-U251细胞后使细胞增殖活性减弱,克隆形成率降低;荧光定量PCR及Western-blot检测HCMV感染显著抑制了siATF5-U251细胞内CD133的表达。因此,抑制ATF5的表达可成为恶性胶质瘤预防和治疗的新的作用靶点。     

Preliminary study of the effects roles of miR-520h on glioma genesis

目的:综合分析胶质瘤标本中基因的表达,体外生物学作用的检测及对临床病例预后的长期随访,评价胶质瘤中miR-520h的生物学作用及其与NF-κB通路的关系.方法:选取46例Ⅱ到Ⅳ级胶质瘤标本,常规RTPCR检测前体microRNA(pri-miR-520h)的表达,免疫组织化学方法评估Ki-67指数;对46例患者的预后进行KPS评分及肿瘤复发与相关死亡率监测;用520h抑制剂转染U251胶质瘤细胞后缺氧培养,Western blotting检测p-NF-κB/p65等蛋白的表达水平.结果:miR-520h的RT-PCR分析及免疫组织化学结果显示,表达前体miR-520h(Pri(+))的病例Ki-67阳性率较低,而表达成熟miR-520h的病例Ki-67阳性率增加;长期随访结果显示,Pri(+)病例的KPS评分比Pri(-)病例显著增高;此外,高表达前体miR-520h (Pri(+))的病例预后较好,肿瘤复发和相关死亡率较低,说明pri-miR-520h(+)病例预后较好;Western blotting显示浓度为200 nmol/L的has-miR-520h抑制剂在缺氧条件下,促进U251胶质瘤细胞中p-NF-κB/p65的表达.结论:miR-520h在胶质瘤的发生中具有重要的作用,成熟miR-520h作为原癌miR,能诱导胶质瘤细胞的发生.     

MicroRNA-409-3p通过靶向ZEB1促进HCMV感染的胶质瘤细胞迁移的机制研究

近年来的临床研究显示人巨细胞病毒(HCMV)与神经胶质瘤关系密切,但HCMV促进胶质瘤进展的机制仍未阐明,而microRNA(miRNA)在神经胶质瘤中被检测到异常表达,因此提出潜伏感染的HCMV会通过调节宿主细胞miRNA从而影响神经胶质瘤发生发展的假设。首先通过转录组分析和细胞实验,证实miR-409-3p在HCMV感染后显著下调。生物信息学预测显示锌指结合蛋白1(ZEB1)为其下游靶基因。miR-409-3p过表达后的细胞划痕实验以及Transwell迁移实验证实,miR-409-3p的过表达会导致ZEB1下调并抑制胶质瘤U87细胞迁移,而外源性过表达ZEB1可恢复U87细胞迁移能力。研究结果表明,潜伏感染的HCMV能够通过下调宿主细胞中miR-409-3p,从而上调ZEB1表达,促进神经胶质瘤细胞迁移。     

miR-193b通过负向调控MCT7基因的表达抑制人胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭

为探讨miR-193b对人胶质瘤U251细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用HiPerFect转染试剂瞬时转染miR-193b模拟物(mimics)上调U251细胞中miR-193b的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率,然后进行细胞划痕实验及侵袭实验,分别检测miR-193b对U251细胞迁移及侵袭能力的影响.结果显示过表达miR-193b可抑制U251细胞迁移和侵袭的能力.应用生物信息学软件预测,提示单羧酸转运蛋白7(MCT7)基因可能是miR-193b的潜在靶基因.进而构建双荧光素酶报告基因系统从转录水平上证明MCT7为miR-193b调控的靶基因;qRT-PCR及蛋白质免疫印记(Western blot)分别在mRNA和蛋白水平上进一步证明MCT7基因的表达受miR-193b的负调控.由此可见,miR-193b很可能通过负向调控MCT7基因的表达来抑制U251细胞的迁移与侵袭.     

抑癌基因ING1在鼻咽癌中的表达及突变分析

本研究运用免疫组化技术、逆转录 - PCR( RT- PCR) ,PCR- SS-CP技术对鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系中 ING1的表达和突变进行检测 .结果发现 3 0例鼻咽癌标本中 ING1蛋白表达下调率为 70 % ( 2 1/ 3 0 ) ;ING1m RNA表达明显下调率为 4 6% ( 12 / 2 6) ,6例鼻咽癌细胞系中有 2例鼻咽癌细胞系表达明显下调 ,而 11例 ( 4 2 .5 % ) NPC组织及其它 4例细胞系表达与正常水平相当 ,另有 3例 ( 11.5 % )鼻咽癌组织过表达 ;单链构像多态性分析 ( SSCP)在鼻咽癌及鼻咽癌细胞系中均未发现突变 .结果表明ING1基因的转录及翻译表达水平与鼻咽癌的发生 /发展呈负相关 ,该基因的异常表达是鼻咽癌发生中的频发事件而与基因突变无关