小鼠囊胚玻璃化冷冻保存研究

在20°C室温下,用玻璃化冷冻液(体积分数为0.4的乙二醇,质量浓度为0.18kg/L的葡聚糖和0.3mol/L海藻糖)对昆明小白鼠囊胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存.一步法的1min平衡组和二步法的0.5min平衡组胚胎解冻后,体外培养24h后的发育率较高,都为91%,与对照组(98%)相比无显著差异(P＞0.05);体外培养48h后的囊胚孵化率较好,分别为48%和51%,但与对照组(90%)相比,均有极显著差异(P＜0.01).将此两组冷冻囊胚植入假孕3d的受体鼠子宫内,其产仔率分别为43%和50%,与对照组(55%)相比,均无显著差异(P＞0.05).     

早期胚胎玻璃化冷冻保存技术研究进展

胚胎冷冻技术是胚胎移植真正走向商业化应用的关键环节,并受到广泛的关注,而玻璃化冷冻不仅具有操作时缩短、而且方法简易、不需要昂贵的设备,容易在生产中推广使用,因而日益受到人们的重视。本综述阐明了胚胎玻璃化冷冻原理,讨论了抗冻保护剂及其选择原则,比较了玻璃化冷冻技术各种方法及其优缺点,分析胚胎玻璃化冷冻的影响因素,展望了玻璃化冷冻技术的应用前景。     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻保存研究

为了摸索小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的简易方法,采用常规冷冻和玻璃化冷冻2种模式,探讨了不同的冷冻方法、不同的冷冻前平衡时间、不同的冷冻保护液的配比等因素对成纤维细胞冷冻效果的影响。实验结果表明:常规冷冻采用含10%(体积分数)甘油的DMEM液作保护剂,可将0~5℃下平衡时间缩短至45~60 min,细胞活力可达0.87。玻璃化冷冻采用10%(体积分数)NBS+1.8 mol/L乙二醇+0.1 mol/L蔗糖的PBS冷冻小鼠胎儿成纤维细胞效果好于其他组合,细胞活力可达到0.86。玻璃化冷冻法与常规冷冻法的冷冻效果差异不显著。     

影响玻璃化法冷冻保存胚胎的一些因素

探讨了用玻璃化法冷冻保存小鼠桑椹胚的一些影响因素。冷冻胚胎的保护剂采用性质较温和的甘油和1,2-丙二醇组成的玻璃化液,以37℃,体积分数5％CO2条件下能发育到囊胚期为保持正常生命力的指标。结果表明,玻璃化液中的甘油和丙二醇的浓度是冷冻保存胚胎的关键因素,而甘油和丙二醇比例对保存效果也有影响。在所用的不同组合的玻璃化液中,含2．5mol／L甘油和3．5mol／L1,2-丙二醇效果最好。0．25mL的冷冻管比0．5mL的效果更好。     

牛体外受精卵的冷冻保存研究

将胚胎分别以PBS 20?S 10%乙二醇和PBS 20?S 10%甘油为冷冻保护液,或者在PBS 20?S 10%乙二醇中添加或不加蔗糖为保护液,用常规冷冻方法进行冷冻处理.胚胎保存1～18天后将其解冻,并在发育用培养液TCM199 10%OCS(发情母牛血清) 丙酮酸钠中培养48小时.结果表明解冻胚的形态正常率和培养后的发育率在乙二醇处理组和甘油处理组中分别为81.2%(13/19)、56.2%(9/16)和84.6%(11/13)、46.2%(6/13),两组之间无量著差异.在添加蔗糖和不加蔗糖的处理组中,胚胎解冻后的形态正常率和培养后的发育率分别为75.0%(15/20)、55.0%(11/20)和83.3%(15/18)、61.1%(11/18),两组之间也无明曼差异.试验结果证明,用乙二醇为防冻剂对牛体外受精胚胎进行冷冻保存,其效果相当于或略优于甘油,在乙二醇处理组中,添加蔗糖与否并不影响其冷冻效果.     

小鼠胚胎GMP玻璃化超低温保存研究

本实验研究了GMP法(glassmicropipette)冷冻保存小鼠胚胎的主要技术环节,并与目前常用的OPS(openpulledstraws)法比较了冷冻后囊胚率.实验表明,EFS30(87.71%)保护作用比EFS40(81.67%)好,但无显著差异(P>0.05);10%EG(91.37%)预处理优于5%EG(85.93%)、20%EG(88.70%),但差异不显著(P>0.05);玻璃化时间10～30s(89.47%、86.79%)显著优于(P<0.05)60s(64.00%).GMP法与OPS解冻后囊胚率分别为94.02%和92.06%,差异不显著(P>0.05),但GMP法稍好于OPS法.同时,GMP法操作比OPS法更简便.     

小鼠胚胎GMP玻璃化超低温保存研究

本实验研究了GMP法(glass micropipette)冷冻保存小鼠胚胎的主要技术环节,并与目前常用的OPS(open pulled straws)法比较了冷冻后囊胚率.实验表明,EFS30(87.71%)保护作用比EFS40(81.67%)好,但无显著差异(P＞0.05);10%EG(91.37%)预处理优于5%EG(85.93%)、20%EG(88.70%),但差异不显著(P＞0.05);玻璃化时间10～30 s(89.47%、86.79%)显著优于(P＜0.05)60 s(64.00%).GMP法与OPS解冻后囊胚率分别为94.02%和92.06%,差异不显著(P＞0.05),但GMP法稍好于OPS法.同时,GMP法操作比OPS法更简便.     

小鼠不同杂交组合胚胎玻璃化冷冻的研究

通过小鼠胚胎的毒性试验 ,确定对胚胎无毒性或毒性小的冷冻保护剂的种类、适宜浓度 ,以便达到提高冷冻解冻后的胚胎存活率的目的。用小鼠不同杂交组合胚胎进行玻璃化冷冻和解冻后 ,经体外培养观察胚胎的存活率和囊胚孵化率 ,确定了最佳的杂交组合     

黑线姬鼠、锡金小家鼠和高山姬鼠洞穴结构研究

１９８９～１９９１年间笔者在黔西北地区调查农田鼠害时，共挖掘剖析黑线姬鼠洞穴４８个，锡金小家鼠洞穴２４个，高山姬鼠洞穴９个．这３种鼠类的洞穴基本结对均主要由巢明、明洞和暗洞组成，但无便食结构，也未发现有储粮仓及所储藏的粮食。区别这３种鼠类洞穴结构的主要特点是洞口和洞道的排列位置。     

光棘豆（Oxytropis leptophylla DC）愈伤组织超低温冰冻保存技术的研究

光棘豆（ＯｘｙｔｒｏｐｉｓｌｅｐｔｏｐｈｙｌｌａＤＣ）愈伤组织超低温冰冻保存研究结果表明：适宜的保护剂是必要的，本试验所用复合保护剂中以１０％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）＋０．５ｍｏｌ蔗糖效果最佳；两步冰冻法（即以０．５℃／ｍｉｎ的速度由０℃降至－４０℃，停留２ｈ，再投入液氮）能获得较高的存活率；自来水流水冲洗是较好的解冻方法；回温后不洗涤，通过更换培养基逐步稀释保护剂对恢复再生长有利；各环节均采用最佳处理方法，可使冰冻回温后再培养的愈伤组织存活率高达９５％以上；再培养分化出的植株形态及生长状态正常．     

久效磷对小鼠早期胚胎体外发育的影响

采用小鼠早期胚胎的体外培养技术,研究了久效磷对小鼠着床前胚胎发育的影响。结果表明,剂量低于0.22mmol/L对小鼠早期胚胎无明显作用,剂量为0.34mmol/L时,70.6％的8细胞胚胎能发育至囊胚,剂量达0.45mmol/L,对小鼠早期胚胎有显著的毒害作用,只有5.7％可以发育至囊胚。在经久效磷处理的小鼠早期胚胎电镜照片上可以看到,细胞内网架结构保持完好,线粒体被破坏,数量变少,空泡变大、增多,细胞内不同结构对久效磷的敏感性有一定差异。     

人体胃癌DNA转化细胞诱发裸鼠肿瘤的研究

从人体胃癌组织及胃腺癌细胞株SGC7901中分别提取DNA,用来转化NIH3T3小鼠细胞。第二轮转化细胞接种裸鼠体内后产生了肿瘤。就致瘤能力和诱发癌基因的表达水平而言,来源于胃腺癌细胞株DNA的转化细胞均低于来源于胃癌组织DNA的转化细胞及其诱发的肿瘤。人体胃癌细胞在裸鼠体内长成的肿瘤细胞,染色体数目减少,转化细胞引起的肿瘤,染色体数目无明显变化。     

不同化学激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活效果的影响

通过比较几种常用的化学激活方法对小鼠卵母细胞的孤雌激活和孤雌生殖胚胎体外发育的影响,从而筛选出小鼠卵母细胞孤雌激活的适宜方法.选取成熟小鼠卵母细胞,随机分为以下9组进行激活处理:①离子霉素(I)+6-二甲氨基嘌呤(D);②I+D+细胞松弛素B(CB);③I+放线菌酮(C);④I+C+CB;⑤φ(乙醇)=7%的乙醇(E)+D;⑥E+D+CB;⑦E+C;⑧E+C+CB;⑨Sr2++CB.比较了这9种化学激活方法以及SrCl2的作用时间和卵龄对小鼠卵母细胞激活效果的影响.实验结果表明:小鼠卵母细胞孤雌激活率与激活措施和卵龄有关;小鼠卵母细胞可以被I+D+CB或SrCl2+CB有效激活,激活率及孵化囊胚发育率均高于其他激活方法(P0.05),且以SrCl2+CB最为有效.hCG注射后20h为小鼠卵母细胞进行SrCl2激活的最适卵龄,其最佳处理时间为4h.对小鼠卵母细胞而言,6-DMAP比放线菌酮的激活效果好.     

冷冻中甘油对小鼠胚胎保护效果的研究

将小鼠２－细胞、４－细胞、８－细胞以及桑棋期的胚胎快速冷冻,以甘油作低温保护剂,浓度分别为０．５ｍｏｌ／Ｌ,１．５ｍｏｌ／Ｌ,２．５ｍｏｌ／Ｌ,３．５ｍｏｌＬ培养到囊胚阶段。结果表明：随着保护剂浓度的升高,胚胎发育率增加;在囊胚之前,发育程度越高,抗低温的能力越强,胚胎的发育率也就越高,各阶段组发育到囊胚期的胚胎经移植后均能得到正常发育的胎儿。     

国产试剂配制的培养液对小鼠早期胚胎培养效果的研究

本实验用 Whitten 的小鼠早期胚胎培养法验证了国产试剂配制培养液对小鼠早期胚胎体外培养的效果。实验表明,在用国产试剂配制的小鼠早期胚胎培养液中,2—细胞胚胎能正常发育到囊胚阶段。     

微管和微丝在小鼠受精卵原核迁移中的作用

本文用微管、微丝解聚剂处理小鼠体内受精卵,发现雌雄原核的迁移均被抑制,说明雌雄原核的迁移是微管和微丝共同作用的结果。