小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

卵巢运输条件对牦牛卵母细胞质量与胚胎体外发育的影响

卵巢的运输条件是影响卵母细胞的质量与胚胎发育的主要因素之一.为了找到牦牛卵巢的最佳运输温度,将采集的新鲜牦牛卵巢分别置于15-20℃、25-30℃、35-40℃的生理盐水中,1-2 h送回实验室,比较不同运输温度下的可利用COCs回收率、卵母细胞成熟率、孤雌激活与体外受精胚胎的体外发育.结果表明35-40℃运输卵巢能显著提高牦牛可利用COCs回收率(72.0％),但25-30℃组卵母细胞成熟率与其它组差异显著(78.9％);25-30℃组的卵母细胞进行孤雌激活与体外受精后,8细胞和囊胚形成率显著高于其它组(P＜0.05).由此推测:25-30℃为牦牛卵巢的最佳运输温度,能显著提高卵母细胞质量与胚胎体外发育能力.     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢，用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体，对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究，根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度，合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关，大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长，体外成熟，体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟，单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用，将体外受精后发育至２－细胞的胚胎     

旁分泌因子促进家畜卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的研究

1984年,旭日干先生在日本成功培育出世界首例试管山羊,开创了体外受精技术引领的家畜品种改良新时代.之后,旭日干先生带领内蒙古大学科研团队,在1989年培育出了中国首例首批试管牛和试管羊.在此基础上,人们不断优化体外卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的技术路线,摸索出更高效的试管动物制备方法.卵母细胞体外成熟技术是制备试管动物的关键技术之一.在生理条件下,卵巢内的卵母细胞成熟过程受到众多激素和旁分泌因子的调控.人们通过在体外培养体系中添加相应的激素和旁分泌因子,以期提高卵母细胞体外成熟效率.最近,我们发现,旁分泌因子GDNF可以提高牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育效率;CTGF,SDF-1,HGF,NGF四种因子的组合使用可以提高绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育效率.本文将综述这些旁分泌因子对卵母细胞成熟和胚胎发育的促进作用,并提出相关领域未来的研究和应用方向.     

完全体外化牛细胞核移植的研究

本研究探讨了用体外成熟卵母细胞和体外受精胚胎进行核移植的可能性。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。从屠宰场回收的卵巢中抽取卵球－卵母细胞复合体，采用以前报道的方法（石德顺等，广西农业大学学报’１９９４：１３：１－５）进行体外成熟（ＩＶＭ）和体外受精（ＩＶＦ），获得ＩＶＭ卵母细胞和ＩＶＦ胚胎，体外成熟２３－２４ｈ后，在含０．１％透明质酸酶的无钙镁ＰＢＳ（ＰＢＳ）内，用细管反复吹打去掉卵丘细胞。选择具有明显第一极体的卵母细胞通过显微操作移去第一极体及其附近约一半的细胞质进行去核，去核的卵细胞在成熟液内继续培养到ＩＶＭ３０ｈ．体外发育到８－３２细胞期的ＩＶＦ胚胎用作核供体．供体胚胎用含０．２５％Ｐｒｏｎａｓｅ（溶于ＰＢＳ￣－）溶解透明带，并用细管吹打将其分散成单个卵裂球，在ＩＶＭ３０ｈ将单个卵裂球显微注入去核卵母细胞的卵周隙内，并在ＩＶＭ３１ｈ用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲（间隔１秒）来诱导卵裂球与去核卵母细胞的融合。融合卵在颗粒细胞单层培养滴内共培养，体外培养２４ｈ后观察卵裂结果，经体外培养５－８天后发育到桑椹和囊胚的核移植胚胎移植到同期发情的受体．２个月后直检妊娠情况．本实验中共操作１９４枚卵母细胞，     

牦牛,黄牛体外受精比较和分割胚的移植

采用常规方法对黄牛和牦牛卵母细胞的体外受精技术进行初步探索.实验采用相同的成熟液、受精液和培养液,并且两种卵母细胞成熟后均以黑白花冷冻精液进行受精.成熟培养时间为22～26.h.受精后48h移入颗粒单层培养滴中,第6、7、8天记录囊胚发育情况.结果表明：来自屠宰场的不同品种的卵巢在提供卵母细胞的数量上无显著差异（P＞0.05）.50个黄牛卵巢获得344枚可用卵母细胞、回收率为6.9枚／卵巢;30个牦牛卵巢获得206枚可用卵母细胞,回收率为69：16个黄牛加28个牦牛卵巢获得373枚可用卵母细胞,回收率为7.5受精后黄牛、牦牛的卵裂率（69.2％比44.1％）差异极显著（P＜0．01）而囊胚发育率（31.8％比25.0％）差异显著（P＜0.05）牦牛与黄牛卵母细胞共同培养时其卵裂率和发育率比较接近黄牛卵母细胞的发育水平（分别为61、2％和30.5％）挑选部分黄牛杂交胚胎进行分割实验,将其中的四对半胚非手术移入4头发情同步的受体牛．两个月直肠检查有3头妊娠（75％）,其中有两头受体足用分娩,其－产奶黄杂公犊－头,另－受体产一对奶黄杂双胎、－活－死（畸胎）实验表明：常规的体外受精技术用于牦牛是可行的,但其中仍有－些值得改进的地方,另外完全体外化的胚胎分割技术为提高优质良种胚胎的生产效率提供了便捷     

牛胚胎体外生产技术的应用研究

利用屠宰牛卵巢抽出的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验，结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００－２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞标准密度培养，其卵裂率和囊胚发育率没有显著变化，体外授精时间可从成熟培养后２２小时延长至２７小时，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化。卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留孵丘细胞再培养４８小时形     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

绵羊卵母细胞不同采集方法对体外成熟培养的影响

为提高绵羊卵巢卵母细胞的采集效率,提供用于卵母细胞体外成熟培养和体外受精的更多优质的成熟卵母细胞,试验利用抽吸法和剖切法2种采集方法采集绵羊卵巢卵母细胞进行体外成熟培养并对其效果进行了对比研究.结果表明剖切法获得的卵子数量显著高于抽吸法(P<0.05),而所用时间则无显著差异(P>0.05);A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法(P<0.05),抽吸法所采集的C级细胞显著高于剖切法(P<0.05);剖切法中卵丘扩散率和第一极体排出率要显著高于抽吸法(P<0.05).     

体外受精过程中多精受精发生机制

对哺乳动物体外受精（IVF）过程中多精受精的发生原因进行了阐述，指出多精受精的发生是影响各种哺乳动物体外受精效率的重要原因，其中在猪和人的IVF中表现得尤为突出。大量研究表明，除了物种的特异性以外，不完全的卵母细胞胞质成熟、异常透明带、高精子浓度、受精培养基中不适当的添加物以及在受精过程中的其他一些异常因素都与多精受精密切相关。     

体外受精过程中多精受精发生机制

对哺乳动物体外受精(IVF)过程中多精受精的发生原因进行了阐述,指出多精受精的发生是影响各种哺乳动物体外受精效率的重要原因,其中在猪和人的IVF中表现得尤为突出。大量研究表明,除了物种的特异性以外,不完全的卵母细胞胞质成熟、异常透明带、高精子浓度、受精培养基中不适当的添加物以及在受精过程中的其他一些异常因素都与多精受精密切相关。     

富勒烯及其衍生物对小鼠卵母细胞成熟和激活的作用

为探索富勒烯及其水溶性衍生物对哺乳动物卵母细胞减数分裂的作用,使用富勒烯膦酸衍生物(2P)、富勒烯-PVP和富勒醇作用于体外培养的小鼠GV期卵母细胞和超排卵母细胞,通过观察第一极体排出率和原核形成率以判断卵母细胞的成熟和激活,并探讨光照对这一作用的影响.结果表明,在光照和非光照下,富勒烯的PVP水溶液、富勒醇对卵母细胞的成熟没有明显影响,而2P在光照下对卵母细胞的成熟和孤雌激活具有明显抑制作用,其作用有浓度依赖性.     

四氯化碳对雌性小鼠卵母细胞成熟和体外受精等影响

探讨了四氯化碳对小鼠生殖作用的影响.采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了四氯化碳对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精的影响.结果表明:四氯化碳对小鼠脏器、超排卵的卵母细胞数量和卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并可降低体外受精率.四氯化碳可以破坏卵母细胞减数分裂进行,降低卵母细胞的受精能力,具有潜在的生殖毒性.     

体外培养绵羊卵母细胞核质成熟的研究

实验通过研究卵母细胞的核相及皮层颗粒的分布,探讨按照卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后的不同绵羊卵母细胞在体外培养过程中的核质成熟情况,结果表明：（１）小卵泡卵经体外２４ｈ后的核质成熟率分别为４５．９％和２８．２％,远低于大（９３．５％,６６．７％）、中（８５．１％,５１．０％）两类卵泡卵,２）大卵泡卵在体外培养２０ｈ已完成核质成熟,较中等卵泡提前４ｈ。３）ｇｋｐｈｅ ３ｎｆｃ ｃ ｈ ｇｃｆｔ ｐｎ     

牛体外受精技术研究的现状与展望

系统综述了牛体外受精技术研究的现状及存在的问题．并对今后的研究方向和前景提出了展望。牛卵母细胞可在不含血清的成熟培养液中获得受精及胚胎发育能力，促卵泡素、促黄体素及上皮细胞生长因子均对这一过程具促进作用。肝素是迄今最为有效的精子获能处理方法，但在受精过程中对精子获能起决定作用的是卵丘细胞和卵母细胞本身。提高受精质量可明显提高受精卵的胚胎发育能力。体外受精卵可通过改善培养条件或与体细胞进行复合培养发育到囊胚阶段．但后者更为稳定可靠。目前，牛卵母细胞的体外受精分裂率可达８０％，囊胚发育率达４０％左右．两枚鲜胚的移植妊娠率可达５０％～６０％．而两枚冻胚的移植妊娠率仅３０％～５０％。因此，尚需进一步提高体外受精胚胎的活力和改进胚胎的冷冻保存技术。     

中国对虾胚胎发育期卵的形态变化

通过对中国对虾胚胎发育时期卵的形态变化的观察，提出因受内分泌系统调节的启动作用，使卵的成熟、排卵、排精得到协调统一；精子入卵的时间是在卵的第二次成熟分裂中期，表现出第一极体位于受精膜之外，第二极体位于受精膜之内，与资料记载有差异。     

不同种公牛精液对牛卵母细胞体外受精效果影响的研究

分别利用不同个体的海伏特、安格斯和荷斯坦种公牛精液进行体外受精，观察了不同品种不同个体种公牛精液的体外受精效果，利用五种海伏特种公牛精液进行体外受精后卵裂率为１７．６％～７４．７％，囊胚发育率为１．０％～３２．６％，不同个体间差异极显（Ｐ〈０．０１）。利用五种安格斯种公牛精液进行体外受精后卵裂率为３４．７％～８５．３％，囊胚发育率为６．２～４０．５％，不同个体间具极显差异（Ｐ〈０．０１）。利用     

三疣梭子蟹第一次卵巢发育过程中卵母细胞和卵泡细胞超微结构的观察

通过透射电镜技术研究了东海三疣梭子蟹初产卵巢发育过程中卵巢的超微结构的变化.1)三疣梭子蟹初产卵巢发育过程中卵黄发生期可分为初期和后期;2)卵黄发生初期在7~9月间,此阶段卵黄生成以内源性合成为主,卵母细胞核物质外输明显,胞浆内大量的粗面内质网正在进行卵黄物质的内源性合成;3)卵黄发生后期在10月至第二年4月间,卵泡细胞与卵母细胞的结合阶段,卵母细胞借助卵泡细胞进行外源性卵黄物质合成,卵母细胞与卵泡细胞间的界线逐渐消失,部分卵泡细胞由于胞质大量输出仅见胞核,此时内源性卵黄合成仍然存在;4)排卵后,由于大量成熟卵细胞的排出,卵巢组织存在大量的基膜,残留成熟卵母细胞中的卵黄物质已经解体,卵黄颗粒自中央向边缘逐渐松散.     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育的比较

目的对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活,可以间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%,17.7%)明显高于体外成熟21 h或24 h的囊胚发育率(12.3%,13.8%);Ion联合6_DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同培养条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(21.7%,13.0%)。