乌头赤石脂丸汤方对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其可能的分子机制

为了观察乌头赤石脂丸汤方含药血清对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用与可能的分子机制,采用过氧化氢处理H9C2细胞构建氧化应激损伤模型:以乌头赤石脂丸汤、参附汤连续灌胃SD大鼠1周,制备含药血清.将H9C2细胞随机分成空白对照组、模型组、阳性对照组、实验组、空白抑制剂组、模型抑制剂组、阳性抑制剂组、实验抑制剂组。过氧化氢造模浓度为400μmol/L,GDC-0994浓度为1μmol/L,分组给药后培养4h。用CCK-8法检测各组细胞活力,用Western blot法检测细胞中Erk1/2、p-Erk1/2、Nrf2、HO-1蛋白表达水平。实验结果显示:(1)与空白对照组比,模型组的细胞活力显著降低(P0.01),Erk1/2磷酸化的水平降低,Nrf2、HO-1蛋白的表达降低(P0.01);(2)与模型组相比,实验组、阳性对照组细胞活力显著升高(P0.01),Erk1/2磷酸化水平降低,Nrf2、HO-1蛋白的表达降低(P0.01);(3)与阳性对照组相比,实验组细胞活力显著升高(P0.01),Erk1/2磷酸化水平,Nrf2、HO-1蛋白的表达升高(P0.01);各组之间Erk1/2总蛋白表达无差异。(4)GDC-0994能够抑制乌头赤石脂丸汤方对细胞活力的保护作用(P0.01),抑制乌头赤石脂丸汤方对p-Erk1/2,Nrf2,HO-1表达的上调作用(P0.01)。研究表明乌头赤石脂丸汤方可以通过抑制氧化应激途径发挥对H9C2心肌细胞的保护作用,对抗再灌注引起的心肌细胞损伤。该作用是通过促进Erk1/2磷酸化,增强Nrf2、HO-1蛋白的表达,活化Erk1/2/Nrf2/HO-1信号通路进行的。本研究为阐明乌头赤石脂丸的心血管保护作用及治疗急性心肌梗死的作用提供了实验依据。     

维吾尔族妇女宫颈癌及HPV感染与多种基因表达上调的关系

 通过对维吾尔族妇女宫颈癌病变的高表达候选基因筛查分析,寻找族群特异的宫颈癌早期预警分子指标及其与HPV感染的相关性。收集维吾尔族妇女患者子宫颈新鲜组织标本85例,其中子宫颈鳞癌53例,慢性宫颈炎32例作为对照。提取组织DNA和RNA,利用HPV特异性PCR引物鉴定HPV感染阳性和型别,采用半定量RT-PCR方法对鉴定7种候选基因的转录表达水平变化。结果表明,宫颈炎或癌旁正常组织中的TK1、SPP1和ARPC2/3 mRNA检出率较低(25%—28%),在宫颈鳞癌中明显增高(62%—66%),其差异显著(P＜0.05);但是ANX8、HSPA1A、S100-A9和S100-P基因的转录表达水平变化不明显,其差异也无统计学意义(P＞0.05)。从HPV感染的角度分析,HPV阴性患者的TK1和SPP1 mRNA表达检出率较低(50.0%和44.2%);HPV阳性患者很高(82.9%和74.2%),有统计学意义(P＜0.05)。研究表明,SPP1、TK1和ARP2/3基因表达上调可能是维吾尔族宫颈癌发生的重要标志,其中TK1和SPP1基因表达水平变化可能对HPV感染有依赖关系。     

咖啡酸四聚体异构体基于MAPK/NF-κB信号通路的体外抗炎作用机制研究

目的 探讨从新疆软紫草中提取分离得到的咖啡酸四聚体同分异构体(KC-Ⅱ)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞的体外抗炎作用研究。方法 采用MTT比色法检测细胞活力、Griess法检测细胞中NO含量、RT-PCR检测KC-Ⅱ对LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子的mRNA表达影响,Western Blot检测INOS和COX-2以及Akt、MAPK/NF-κB信号通路的蛋白表达水平,细胞免疫荧光法检测了P-Erk1/2和P-P65蛋白在细胞中的分布以及荧光强度。结果 MTT结果显示,KC-Ⅱ浓度低于300μmol·L^-1时细胞增殖差异无统计学意义;RT-PCR结果显示,与模型组比较,KC-Ⅱ处理组能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中INOS、COX2、IFN-β以及促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达;Western Blot结果表明,KC-Ⅱ处理组明显抑制INOS、COX2的表达以及MAPK/NF-κB信号通路中Erk1/2、Jnk、P65以及IKKα/β的表达。结论 KC-Ⅱ化合物通过抑制MAPK/NF-κB信号通路的Erk1...     

PTTG基因对人垂体瘤细胞侵袭能力的影响

目的：本研究的目的在于PITG基因过表达及沉默对人垂体瘤细胞侵袭力的影响,探讨其与垂体瘤细胞侵袭性的关系及调控机制。方法：用脂质体转染携带PTTG基因的表达质粒,构建过表达PTTG基因的垂体细胞株,观察细胞形态。另外我们运用脂质体转染PITGsiRNA对垂体瘤中的PITG基因进行干扰;利用Western blot技术检测其基沉默效应;通过Transwell小室法测定垂体瘤细胞侵袭能力的改变。结果：转染PITG siRNA后,垂体瘤细胞中PTIG的mRNA转录和蛋白表达受抑,显著低于未经处理的垂体瘤细胞（P〈0.01）。利用PTTGsiRNA对PTTG进行RNA干扰后,垂体瘤细胞的侵袭能力下降。结论：（1）在正常垂体细胞中过表达PTTG基因也可以引起细胞癌变,增强侵袭能力。（2）设计的PTTG siRNA能有效抑制体外培养垂体瘤细胞中PTTG的mRNA转录和蛋白表达水平,实现其基因沉默效应。PTTG与人垂体瘤的侵袭能力密切相关,其表达水平下降导致细侵袭能力降低。     

慢病毒介导的HPV16-E7基因RNAi细胞模型的建立

 建立HPV16-E7基因的RNAi细胞模型,可为进一步研究HPV16-E7蛋白作用及致癌机制提供物质前提。选择HPV16-E7基因特异的siRNA片段,构建慢病毒siRNA重组表达载体,经293FT病毒包装细胞转染产生重组病毒,并以此感染HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞、抗菌素筛选和分子生物学鉴定,建立了稳定表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型。该细胞模型,对目标基因（E7）表达的抑制效率,也以蛋白免疫印迹和RT-PCR确证。由此得出,利用慢病毒载体和HPV16-E7基因特异的siRNA片段,可以建立一种稳定、有效和可行的RNAi细胞模型,为进一步研究E7蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

PIK3CA基因突变及PTEN表达与西妥昔单抗疗效的关系

 对西妥昔单抗治疗的KRAS野生型结直肠癌患者进行疗效评估及随访,收集每例患者的癌组织标本及临床病理资料,检测每例患者BRAF、PIK3CA基因的突变情况,采用免疫组织化学染色检测PTEN在癌及癌旁组织中的表达情况.结果显示,KRAS、BRAF及PIK3CA基因均为野生型的患者对单抗治疗的反应率为62.5%(CR+PR),而存在BRAF及PIK3CA突变患者的反应率分别为0,28.6%,证实BRAF及PIK3CA的突变可显著影响西妥昔单抗(C225)的疗效.PTEN主要表达在细胞核内,在癌组织中表达降低或缺失,在正常组织中表达正常,并且PTEN的表达与C225的疗效密切相关,PTEN表达阳性及阴性患者的反应率(CR+PR)分别为42.9%,36.4%(P＜0.05).BRAF、PIK3CA的突变和PTEN的表达缺失可以显著影响C225的疗效.     

异常黑胆质性哮喘与白细胞介素-13基因多态性的关系

 本文通过对76例哮喘患者按维医体液论进行辨证分型,其中异常黑胆质性哮喘组30例、非异常黑胆质性哮喘组46例、正常对照组89例,采用聚合酶联反应——限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测各组IL-13基因intron3+1923位点及IL-13基因+2044位点的多态性,来探讨新疆维吾尔族异常黑胆质性哮喘与白细胞介素-13(IL-13)基因多态性间的关系.结果发现IL-13基因intron3+1923位点多态性,在三组间有显著性差异(P＜0.01),基因型频率异常黑胆质性哮喘组TT、TC基因型分布频率明显高于非异常黑胆质性哮喘组和正常对照组(P＜0.01),非异常黑胆质性哮喘组TT、TC基因型分布频率高于正常对照组(P＜0.05),而正常对照组CC基因型分布频率明显高于异常黑胆质性哮喘组(P＜0.01)和非异常黑胆质性哮喘组(P＜0.05),非异常黑胆质性哮喘组CC基因型分布频率高于异常黑胆质性哮喘组(P＜0.05),等位基因T、C的频率分布在三组人群中有差异(P＜0.01).T等位基因频率分布异常黑胆质性哮喘组高于正常对照组(P＜0.01).C等位基因分布频率异常黑胆质性哮喘组低于正常对照组(P＜0.05).IL-13基因+2044位点基因型频率及等位基因频率分布在各组间比较无差异(P＞0.05).结果表明,新疆维吾尔族异常黑胆质性哮喘可能与IL-13基因intron3+1923位点多态性有关,而与IL-13基因+2044位点无关.     

丹参酮ⅡA对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的影响

以人自发性永生化角质形成细胞系(HaCaT)细胞为材料, 通过CCK8和蛋白印迹法分别测定不同剂量长波紫外线(ultraviolet A, UVA)、不同浓度丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA,TSⅡA), 以及UVA和TSⅡA共同作用下的细胞活力和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogenactivatedprotein kinase, MAPK)信号通路蛋白(p38, JNK和Erk)磷酸化水平. 结果表明:在10 J/cm2的UVA照射下, 细胞活力为对照组的70%左右, 在20 J/cm²的UVA照射下, 细胞活力仅为对照组的55%左右; 低浓度的TSⅡA在正常情况下对细胞活力无影响, 高浓度(85 μmol/L) TSⅡA处理组的细胞活力约为对照组的70%左右. 与TSⅡA或UVA单独处理相比, 二者共同作用下细胞活力大大降低且差异极其显著. UVA照射提高了MAPK信号通路中的p38和JNK磷酸化水平, 但是对Erk磷酸化水平没有影响; 而TSⅡA可以显著提高低辐射剂量(2 J/cm²)UVA诱导下的p38和JNK的磷酸化水平. 这说明UVA促进HaCaT细胞凋亡是通过提高p38和JNK磷酸化水平来实现的; 而TSⅡA可以提高p38和JNK磷酸化水平,进一步加速UVA诱导的HaCaT细胞凋亡.     

琐琐葡萄多糖对PC12细胞损伤的神经保护作用

 体外培养PC12细胞,采用20μmol/L β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)作用24h诱导细胞损伤,建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型,研究琐琐葡萄多糖(VTP)对PC12细胞损伤的神经保护作用。设立对照组、模型组和VTP保护组(20,40,80μg/mL),CCK-8法检测各组细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜通透性及完整性,化学比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,20,40,80μg/mL VTP可提高PC12细胞存活率,减少LDH渗漏,增加SOD活力,减少MDA含量,降低细胞凋亡率,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。由此推论,VTP对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化损伤具有明显的保护作用。     

PinX1基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用

探讨了PinX1 基因在乳腺癌MCF-7 细胞生长和细胞周期中的作用, 初步探讨了该基因用于乳腺癌临床治疗的可行性. 采用RT-PCR 技术从293-T 细胞中扩增PinX1 基因, 将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1 中, 再将重组质粒转染MCF-7 细胞. 通过real-time PCR 检测PinX1 基因的mRNA 表达, 用MTT 法检测转染前后细胞生长曲线的变化, 用流式细胞仪检测转染目的基因后细胞生长周期的改变. 检测结果表明, PinX1 基因已经在转染后MCF-7 细胞的细胞核内稳定表达, 乳腺癌细胞生长明显减缓(P <0.05), 增殖变慢(P <0.05), 细胞生长阻滞于G0/G1 期, 说明PinX1 基因可抑制乳腺癌MCF-7 细胞的生长和增殖.     

HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体的构建及其体外转录制备感染性RNA的研究

运用重叠延伸PCR方法对HCV全长基因组cDNANS3和NS5A上的E1202G、T1280I和S2197P进行细胞培养适应性突变,构建含有细胞培养适应性突变的HCV全长基因组cDNA,体外转录制备RNA,脂质体法转染人肝癌细胞Huh-7,以RT-PCR检测HCV正、负链RNA,间接免疫荧光法和Western blot检测细胞内HCVNS3蛋白的表达。结果证明,转染后细胞内可间断检测到HCV正、负链RNA及HCVNS3蛋白的表达,且突变体RNA与未突变的HCVRNA相比,明显具有更高的复制效率和蛋白表达。该研究为后续HCV体外培养体系的研究提供了可在细胞内高效自主复制的HCV病毒模板。     

Ras /MAPK / ERK 通过协同 NF- KB 促进肝癌细胞中 cyclinD1 的表达

摘要: 目的 探讨 Ras 癌基因在体内诱导肝肿瘤发生过程中促进 cyclin D1 表达的分子机制。方法 利用 H-ras12V 转基因雄鼠肝肿瘤组织、肿瘤周围组织以及非转基因雄鼠肝组织进行病理分析和总 RNA 及蛋白质的提取。应用 qRT-PCR 和 Western blot 方法检测 cyclin D1 的表达以及调控 cyclin D1 表达的相关信号通路激活状态。采用 miRNA 测序、生物信息学分析和 qRT-PCR 验证方法检测 miR-5102 基因的表达水平。结果 与非转基因雄鼠肝组 织和肿瘤周围组织相比,肿瘤组织中 cyclin D1 基因的 mRNA 和蛋白表达水平显著升高。与非转基因雄鼠肝组织 和肿瘤周围组织相比,在肿瘤组织中 MAPK 信号转导通路中的 ERK 信号分子的蛋白表达水平和磷酸化水平都显 著升高,在肿瘤组织中成高激活状态,NF-KB 信号通路中的抑制因子 IKB 蛋白水平显著降低。miR-5102 的表达水 平没有显著变化。结论 在 Ras 癌基因诱导的肝肿瘤发生过程中,主要通过激活 MAPK/ERK 和 NF-KB 信号通路促进 cyclin D1 的表达。     

靶向沉默人HER2/neu基因的RNA干扰

针对人HER2/neu基因的mRNA序列, 设计并构建shRNA干扰载体, 经聚合酶链式反应(PCR)及测序鉴定后转染SK-BR-3细胞, 并检测HER2/neu mRNA和蛋白抑制情况及SK-BR-3细胞迁移能力的变化. 实验结果表明： 构建了3个HER2/neu shRNA真核表达质粒; 3个重组质粒均可不同程度下调HER2/neu mRNA和蛋白表达水平, 并抑制SK BR 3细胞的迁移; 其中1号重组质粒效应最强, 对mRNA和蛋白的抑制率分别为84.65%和7498%.     

五味子中残留农药对卵巢颗粒细胞的毒性研究

探讨五味子中残留农药对卵巢颗粒细胞的毒性作用.MTT法测定农药提取物作用于卵巢颗粒细胞24、48、72 h后的细胞增殖情况;Western blot法检测农药提取物对卵巢颗粒细胞MAPK信号通路的ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达水平的影响.MTT结果显示农药提取物能够显著促进卵巢颗粒细胞增殖,48 h增殖率最高(P0.01),Western blot结果显示提取物能够促进ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达,与阴性对照组相比差异极显著(P0.01).因此农药提取物作用于体外培养的卵巢颗粒细胞能够显著促进细胞增殖,通过促进MAPK信号通路的ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达,对颗粒细胞产生毒性作用.     

丙型肝炎病毒感染与ras,p53基因表达的相关性

为了探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染与肝细胞癌（ＨＣＣ）的关系以及ＨＣＶ可能的致癌机理，采用免疫组织化学方法及巢式ＰＣＲ法检测了１３６例肝细胞癌等肝病组织中的ＨＣＶＮＳ３抗原、ＨＣＶＲＮＡ及Ｐ２１、Ｐ５３蛋白。结果表明，肝细胞癌及癌周肝组织中有ＨＣＶＮＳ３抗原及ＨＣＶＲＮＡ检出，支持ＨＣＶ与ＨＣＣ的关联。Ｐ２１在ＨＣＣ、肝炎后肝硬化、慢性肝炎、体质性黄疸各组中的检出率随病变的加重而逐渐增高，在ＨＣＣ的癌及癌周组织中Ｐ２１呈致密的过量表达，提示ｒａｓ癌基因的激活在ＨＣＣ的发生过程中起一定作用。Ｐ５３的阳性率较Ｐ２１低，但ｐ５３的突变似乎也是肝癌发生的协同因素之一。组织中Ｐ２１的过量表达与ＨＣＶＮＳ３抗原阳性检出呈正相关，ＨＣＶＮＳ３抗原与Ｐ２１的这种关联提示，ＨＣＶ感染作为ＨＣＣ的密切相关因素之一，可能通过激活某些癌基因或使某些抑癌基因突变而致肝细胞癌变     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。