循环肿瘤细胞分离富集与分析检测技术的研究进展

癌症死亡患者中有90%由癌症转移引起,研究表明:患者的外周血、胸腔液等体液中的循环肿瘤细胞(CTC)与癌症转移及肿瘤结节转移(TNM)分期密切相关.因此,CTC检测在实体肿瘤前期诊断、预后及疗效评估等方面扮演着举足轻重的角色.该综述基于CTC区别于正常细胞的物理学、电学、生物学特征,总结了目前CTC分离富集及分析检测技术的研究进展,并就国内外CTC检测面临的挑战进行了讨论,对其未来发展趋势进行了展望.     

纠正EDTA-K2抗凝剂致假性血小板减少的方法探讨

目的:探讨EDTA-K2抗凝剂致血小板假性减少的原因及纠正方法.方法:选取健康体检者30名和EDTA-K2依赖性血小板假性减少者5名,同时采集EDTA-K2抗凝静脉血2ml和置于160μl稀释液中的末梢血40μl,分别在sysmex-2000i全自动血球计数仪进行静脉血和末梢血的血小板计数,比较静脉血和末梢血的血小板数,同时用光学显微镜对瑞氏-姬氏染色后的EDTA-K2抗凝血进行血涂片观察.结果:健康组EDTA-K2抗凝静脉血和稀释的末梢血血小板数相比,差异不明显,无统计学意义(P＞0.05).血涂片上血小板大小、形态、分布正常.EDTA依赖性血小板减少患者静脉血和稀释的末梢血血小板计数相比,差异明显,有统计学意义(P＜0.001).在血涂片尾部有大量血小板聚集,数量不等.结论:EDTA-K2抗凝剂可对部分患者血小板计数造成假性减低,但通过稀释的末梢血计数血小板联合涂片观察,就可以纠正假性血小板减低,避免临床误诊的发生.     

基于物理性质捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片

为满足利用微流控技术实现芯片上循环肿瘤细胞捕获日益增长的需求,研制出基于肿瘤细胞尺寸和变形性进行分离的微流控芯片。基于细胞尺寸和变形性差异原理设计芯片,利用半导体加工技术制备出以玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料的微流控芯片,使用8μm间隔的微柱作为捕获单元,应用于乳腺癌细胞系MCF-7肿瘤细胞的捕获;并以MCF-7细胞为模型,考查了芯片的分选条件和分选效果。在1 mL/h流速下,MCF-7细胞捕获率可达到68%;多次实验结果表明该芯片捕获的最佳流速为1 mL/h。Calcein-AM和Hoechst对MCF-7细胞进行染色,可方便对捕获后细胞进行识别和拍照。结果基于细胞尺寸和变形性原理所设计的捕获循环肿瘤细胞微流控芯片操作简单、成本低、通量高,有望逐步用于临床循环肿瘤细胞检测。     

基于磁分选技术和间接免疫荧光技术的肺癌A549细胞的分离检测

采用磁分选技术及间接免疫荧光技术分离检测肺癌循环肿瘤细胞(CTCs).将表皮生长因子受体(EGFR)抗体连接到四氧化三铁(Fe3O4)磁珠表面构建免疫磁珠(MNPs-Anti-EGFR),通过EGFR抗体和肺癌A549细胞的表面抗原的特异性结合,将免疫磁珠与肺癌细胞结合.通过磁场作用,使肺癌细胞在磁场的作用下从混合细胞中分离富集.分离出的细胞利用间接荧光技术在其细胞表面连接结合PE荧光团的特异性抗体,并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色以定位细胞位置.通过倒置荧光显微镜的观察,从而实现对肿瘤细胞的定量计数检测.实验结果显示该方法对肺癌A549细胞具有较好的检测灵敏度和检测下限,检测下限可达3 cells/m L.     

循环肿瘤细胞在卵巢癌中的作用

循环肿瘤细胞(CTCs)是指从肿瘤的原发灶或转移灶释放到循环系统的肿瘤细胞.CTCs在很多恶性肿瘤中都有研究,但CTCs在卵巢癌中的研究极少受到关注.以前认为卵巢癌的主要转移方式是经腹膜直接转移,只有1/3病人会发生沿血道的远处转移,因此外周血中的CTCs数量不多.最近研究表明血液播散在卵巢癌的转移中有重要作用,并且血液中CTCs与病人预后相关.而CTCs在卵巢癌中预后诊断价值依赖于CTCs的分离和检测方法.本研究就卵巢癌外周血循环肿瘤细胞的分离、检测方法、CTCs的鉴定分子和临床应用作一综述.     

甘草查尔酮B体外细胞毒作用研究

为考察甘草查尔酮B(Licochalcone B)对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用,初步探讨其作用机制,本研究采用MTT染色法检测甘草查尔酮B对5种肿瘤细胞人乳腺癌细胞(MCF-7)、人膀胱移行细胞癌细胞(T24)、人宫颈癌细胞(HeLa)、高转移性小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F0)的增殖抑制作用;台盼蓝拒染法测定甘草查尔酮B对B16F0细胞的致死率;相差显微镜观察细胞形态;JC-1染色测定线粒体膜电势(△Ψm)。结果表明:甘草查尔酮B(5、7.5、10、12.5、15μg/mL)可浓度依赖性地抑制5种不同肿瘤细胞的增殖,在最高浓度时,抑制率分别为67.52%、67.24%、65.41%、62.81%、68.13%;随甘草查尔酮B处理浓度的增加,B16F0细胞死亡率升高,细胞皱缩,脱落细胞增多;甘草查尔酮B可明显降低B16F0细胞的线粒体膜电势,且呈现浓度依赖性。以上结果显示:甘草查尔酮B对多种肿瘤细胞体外增殖均有明显的抑制作用,这可能与其所致的线粒体损害有关。     

兔血清诱导Shope肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的：前期实验结果已证明兔血清对Ｓｈｏｐｅ肿瘤细胞具有伤作用。本实验拟从细胞凋亡角度探讨兔血清杀伤该细胞的机理。方法：通过电子显微镜、激光共聚焦显微镜、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪检测等方法,观察了兔血清诱导细胞凋亡的可能性。结果：经１０％兔血清处理３ｈ的中等分化程度的Ｓｈｏｐｅ肿瘤细胞（ＳＣＢ－６ａ）在电镜、激光共聚焦显微镜下均可见典型的细胞凋亡的形态学特征;１．５％琼脂糖凝胶电泳呈现明显的“阶梯状”图谱（ＤＮＡ ｌｅｄｄｅｒ）;ＰＩ染色后经流式细胞仪检测显示大量亚二倍体细胞（凋亡细胞）。结论：兔血清诱导Ｓｈｏｐｅ肿瘤细胞凋亡可能是其伤细胞的作用机理之一。     

肾上腺素受体对慢性阻塞性肺疾病患者内皮祖细胞修复的作用机制

目的 探讨肾上腺素受体在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血内皮祖细胞中的表达及作用.方法 将110例COPD患者设为COPD组,62例同年龄段健康志愿者为对照组.抽取受试者外周静脉血,密度梯度离心联合免疫磁珠法分离外周血早期内皮祖细胞;RT-PCR和Western blot检测早期内皮祖细胞中 β2肾上腺素受体mR...     

大学生的静脉血与末梢血对血常规检验结果影响分析

目的分析比较静脉血与末梢血的血常规检测结果的差异性,为临床血常规检验的标准化操作提供理论和实验依据。方法选取128名参加健康体检的大学生作为研究对象,同时采集静脉血和末梢血在全自动血细胞分析仪上进行检测,并对检测结果中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)和血小板(PLT)8项主要指标进行统计分析。结果静脉血与末梢血的WBC、RBC、HGB、HCT和PLT 5项指标平均水平差异具有统计学意义(P<0.05);MCV、MCH和MCHC 3项指标平均水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论末梢血的血常规检测结果与静脉血存在明显差异。在临床血常规检测中,静脉血不易受气温和末梢循环变化等因素的影响,能准确反映全身血液真实情况,更具有代表性。     

Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology

Viable tumour-derived epithelial cells (circulating tumour cells or CTCs) have been identified in peripheral blood from cancer patients and are probably the origin of intractable metastatic disease. Although extremely rare, CTCs represent a potential alternative to invasive biopsies as a source of tumour tissue for the detection, characterization and monitoring of non-haematologic cancers. The ability to identify, isolate, propagate and molecularly characterize CTC subpopulations could further the discovery of cancer stem cell biomarkers and expand the understanding of the biology of metastasis. Current strategies for isolating CTCs are limited to complex analytic approaches that generate very low yield and purity. Here we describe the development of a unique microfluidic platform (the 'CTC-chip') capable of efficient and selective separation of viable CTCs from peripheral whole blood samples, mediated by the interaction of target CTCs with antibody (EpCAM)-coated microposts under precisely controlled laminar flow conditions, and without requisite pre-labelling or processing of samples. The CTC-chip successfully identified CTCs in the peripheral blood of patients with metastatic lung, prostate, pancreatic, breast and colon cancer in 115 of 116 (99%) samples, with a range of 5-1,281 CTCs per ml and approximately 50% purity. In addition, CTCs were isolated in 7/7 patients with early-stage prostate cancer. Given the high sensitivity and specificity of the CTC-chip, we tested its potential utility in monitoring response to anti-cancer therapy. In a small cohort of patients with metastatic cancer undergoing systemic treatment, temporal changes in CTC numbers correlated reasonably well with the clinical course of disease as measured by standard radiographic methods. Thus, the CTC-chip provides a new and effective tool for accurate identification and measurement of CTCs in patients with cancer. It has broad implications in advancing both cancer biology research and clinical cancer management, including the detection, diagnosis and monitoring of cancer.     

多功能化纳米材料络合物体外特异性结合和调控结肠癌细胞的研究

 循环肿瘤细胞(CTCs)因携带原发肿瘤的一些生物特性以及自身独特的生物学功能,在癌症的诊断、治疗和转移预防方面发挥着重要作用.但外周血中CTCs 的低含量使其检测、分离和富集有一定技术难度.本文选取结肠癌HT29 细胞为CTCs 模型,以表面高表达的EpCAM 为生物标记物,选取纳米级高分子聚合物G6 PAMAM dendrimers 为基质,多价络合针对EpCAM的抗体来构建络合物,实现体外对HT29 细胞的特异性捕获及活性调控.应用红外、动态光散射、紫外和荧光等方法表征络合物的理化特性,荧光分析法考察络合物对HT29 细胞的识别和捕获,MTT、荧光拍照、流式分析法显示络合物对捕获的HT29 细胞的活性调控.结果表明,制备的络合物可以高特异性地识别和结合贴壁的和悬浮的HT29 细胞,从而对捕获的细胞产生一定的活性下调作用,但不产生严重的细胞毒效应.可见,利用具有多价络合效应的纳米材料来共价连接针对CTCs 表面标记物的靶向抗体,有望实现在病人血中对CTCs 的特异性捕获和活性调控.     

RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis

Circulating tumour cells (CTCs) shed into blood from primary cancers include putative precursors that initiate distal metastases. Although these cells are extraordinarily rare, they may identify cellular pathways contributing to the blood-borne dissemination of cancer. Here, we adapted a microfluidic device for efficient capture of CTCs from an endogenous mouse pancreatic cancer model and subjected CTCs to single-molecule RNA sequencing, identifying Wnt2 as a candidate gene enriched in CTCs. Expression of WNT2 in pancreatic cancer cells suppresses anoikis, enhances anchorage-independent sphere formation, and increases metastatic propensity in vivo. This effect is correlated with fibronectin upregulation and suppressed by inhibition of MAP3K7 (also known as TAK1) kinase. In humans, formation of non-adherent tumour spheres by pancreatic cancer cells is associated with upregulation of multiple WNT genes, and pancreatic CTCs revealed enrichment for WNT signalling in 5 out of 11 cases. Thus, molecular analysis of CTCs may identify candidate therapeutic targets to prevent the distal spread of cancer.     

乳腺癌患者细胞免疫指标的检测及意义

目的检测乳腺癌患者外周血T淋巴细胞总数及CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、CD45RA~+T细胞、CD45RO~+T细胞等T淋巴细胞亚群的百分率,用以评价患者的免疫状态.方法选择女性原发性乳腺肿瘤患者50例为病例组,并以病理检查的TNM分期结果做进一步分组,其中乳腺癌Ⅰ期27例,乳腺癌Ⅱ+Ⅲ期23例;选择女性健康体检者40例为健康对照组.应用流式细胞仪,分别检测各组外周血T淋巴细胞亚群的数量,统计分析各组检测结果的差异性.结果乳腺癌Ⅱ+Ⅲ期组CD3~+T细胞和CD4~+T细胞百分率明显低于正常对照组和乳腺癌Ⅰ期组,差异具有统计学意义(P0.05);乳腺癌Ⅰ期组CD45RA~+T细胞明显低于正常对照组,乳腺癌Ⅱ+Ⅲ期组CD45RA~+T细胞明显低于乳腺癌Ⅰ期组,差异具有统计学意义(P0.05);乳腺癌Ⅰ期组CD45RO~+T细胞明显高于正常对照组,乳腺癌Ⅱ+Ⅲ期组CD45RO~+T细胞明显高于乳腺癌Ⅰ期组,差异具有统计学意义(P0.05).结论T细胞亚群检测是评价肿瘤患者细胞免疫功能的重要指标,具有重要的临床应用价值.乳腺癌患者免疫功能与肿瘤恶变的发生、发展、临床分期有一定相关性,随着病情的进展,机体免疫功能呈现下降趋势.     

维医异常黑胆质证与肿瘤患者血浆脂肪酸含量变化的相关性

 从脂肪酸代谢水平阐释“异病同证”、“同证同理”等维医基础理论的科学性以及探讨不同肿瘤异常黑胆质证患者体内脂肪酸代谢变化。肿瘤病异常黑胆质证患者122 例,其中包括食管癌患者25例、肠癌患者20 例、肺癌患者33 例、乳腺癌患者20 例和胃癌患者24 例;另选35例健康志愿者为对照组;采用气相色谱法（gas chromatography,GC）对患者血浆进行10 种脂肪酸的定量检测;对患者与健康对照组之间的不同脂肪酸含量的差异性采用SPSS 16.0 软件进行独立样本的t 检验。结果显示,肉豆蔻酸在食管癌、肠癌、肺癌、乳腺癌和胃癌异常黑胆质证患者体内的含量均明显升高,这是本研究中所有肿瘤患者共同的特点;食管癌异常黒胆质证患者体内棕油酸、油酸、花生酸和DHA 含量明显升高,而亚油酸、花生四烯酸含量明显降低;肠癌异常黑胆质证患者体内棕榈酸和油酸含量明显升高;肺癌异常黑胆质证患者体内棕油酸、棕榈酸、油酸和花生酸含量明显升高,而亚油酸含量明显降低;乳腺癌异常黑胆质证患者体内棕油酸、棕榈酸、油酸、花生酸和EPA 含量明显升高,而硬脂酸和花生四烯酸含量明显降低;胃癌异常黑胆质证患者体内的棕油酸和DHA 含量明显升高,而亚油酸、EPA 和花生四烯酸含量明显降低。由此得出,不同病种肿瘤异常黑胆质证患者血浆脂肪酸代谢特点有共性,也有明显的差异性。     

长春瑞滨联合顺铂治疗32例晚期转移性乳腺癌

目的:评价国产长春瑞滨(NVB,商品名盖诺)联合顺铂(DDP)治疗晚期转移性乳腺癌的临床疗效和毒副反应.方法:32例晚期转移性乳腺癌患者第1、8天采用长春瑞滨25 mg/m2,静脉滴注;第1～3天用DDP30 mg/m2,静脉滴注.21 d为1周期,2周期后评价疗效.结果:全组均可评价,完全缓解(CR)4例,部分缓解(PR)14例.有效率(RR)为56.25%.剂量限制性毒性为骨髓抑制,外周静脉炎的发生率亦较明显.结论:长春瑞滨联合顺铂对晚期转移性乳腺癌有较高疗效,毒副反应可耐受.     

基于核磁共振代谢技术研究宫颈上皮内瘤样变患者血浆代谢物

探讨宫颈上皮内瘤样变(CIN)和健康人血浆差异性代谢成分,分析利用基于核磁共振(NMR)代谢组学技术诊断宫颈癌的可行性。收集新疆医科大学第一附属医院病理确诊的36例CIN患者及36名健康人血液标本,应用NMR技术结合正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)对NMR谱数据进行模式识别分析,其结果与液基薄层细胞学(TCT)检测结果比较。结果表明,与健康人相比,CIN患者血浆中极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸和丙酮含量增加,与健康人血浆代谢物比较,差异有统计学意义(r-0.349,P0.05)。乳酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、肌酸、异亮氨酸和1-甲基组氨酸等多种氨基酸含量减少,与健康人血浆代谢物比较,差异具有统计学意义(r+0.349,P0.05)。基于NMR代谢组学技术结合OPLS-DA可以将CIN患者与健康人鉴别开来,其诊断灵敏度为91.7%,假阳性率为8.3%,优于TCT检测。由此得出结论,基于NMR代谢组学技术结合OPLS-DA能有效区分CIN和健康人的血浆代谢物。该技术有望成为早期诊断宫颈癌的一个新手段。     

乳腺癌患者血浆和尿液的1H-NMR代谢组学

 为探讨乳腺癌患者血浆、尿液代谢组学变化，建立早期诊断的代谢标志物体系。选取乳腺癌患者45例，健康对照30例，获得血浆1H-NMR谱图，对所得自由衰减信号进行分段积分、数据归一化后用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）进行模式识别。与健康人群相比，乳腺癌患者血浆中多种氨基酸含量下降，包括亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、脂类（LDL）、β-葡萄糖、乳酸、胆碱、肉碱、肌醇显著减少，差异具有统计学意义（P<0.05）；血浆糖蛋白、丙二酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸、丙酮显著增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。与健康人相比，乳腺癌患者尿液中异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、二甲胺、马尿酸、甜菜碱、牛磺酸、琥珀酸、柠檬酸、肌酸、肌酸酐减少，差异具有统计学意义（P<0.05）；乳酸增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。通过乳腺癌患者的代谢组学的变化，建立可以用于乳腺癌早期诊断的血浆、尿液代谢标志物体系。     

A data-mining approach to biomarker identification from protein profiles using discrete stationary wavelet transform

Objective： To develop a new bioinformatic tool based on a data-mining approach for extraction of the most informative proteins that could be used to find the potential biomarkers for the detection of cancer. Methods： Two independent datasets from serum samples of 253 ovarian cancer and 167 breast cancer patients were used. The samples were examined by surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （SELDI-TOF MS）. The datasets were used to extract the informative proteins using a data-mining method in the discrete stationary wavelet transform domain. As a dimensionality reduction procedure, the hard thresholding method was applied to reduce the number of wavelet coefficients. Also, a distance measure was used to select the most discriminative coefficients. To find the potential biomarkers using the selected wavelet coefficients, we applied the inverse discrete stationary wavelet transform combined with a two-sided t-test. Results： From the ovarian cancer dataset, a set of five proteins were detected as potential biomarkers that could be used to identify the cancer patients from the healthy cases with accuracy, sensitivity, and specificity of 100%. Also, from the breast cancer dataset, a set of eight proteins were found as the potential biomarkers that could separate the healthy cases from the cancer patients with accuracy of 98.26%, sensitivity of 100%, and specificity of 95.6%. Conclusion： The results have shown that the new bioinformatic tool can be used in combination with the high-throughput proteomic data such as SELDI-TOF MS to find the potential biomarkers with high discriminative power.     

用PSAmRNA指标检测前列腺癌的微转移

本文报道了以前列腺特异性抗原的ｍＲＮＡ为标志,用反转录－二次ＰＣＲ（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）技术,检测前列腺癌患者外周血中的前列腺肿瘤细胞,以此推测患者的微转移情况,其检测灵敏度已达到１０＾６,并对该指标的临床意义作了初步探讨。