利用基因组改组技术提高辅酶Q10产量

 辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是生物细胞呼吸链中的重要递氢体,已广泛应用于心脏病、肝炎、帕金森症等多种疾病的治疗中.为了提高微生物法生产CoQ₁₀的产量,本文利用基因组改组技术选育类球红细菌辅酶Q₁₀高产菌株.根据CoQ₁₀的合成途径及作用机理,确定了不同的抗性筛选标记物：罗红霉素、卡那霉素、对羟基苯甲酸、维生素K3和硫化钠.根据类球红细菌对标记物的耐受性确定了抗性筛选浓度.通过紫外线、紫外线/氯化锂、硫酸二乙酯、微波及钴60 5种诱变方式以及抗性培养基筛选获得了9株改良的突变株作为出发菌株.通过一轮基因组改组得到了几株高产菌株,其中PN13产CoQ₁₀的量可达到2.39mg/g,是原菌的2.52倍.     

甘蔗糖蜜促进类球红细菌辅酶Q10的糖转化效率

考察了甘蔗糖蜜对类球红细菌发酵生产辅酶Q₁₀生物合成的影响,优化得到最佳的甘蔗糖蜜添加工艺,提升了糖转化率,大幅度降低了生产成本。不同碳源底物对辅酶Q₁₀产物合成有较大的影响,其中葡萄糖为最适碳源,利于类球红细菌菌体的生长和辅酶Q₁₀的合成。通过正交试验对辅酶Q₁₀发酵培养基进行了优化,当甘蔗糖蜜质量浓度为20 g/L、葡萄糖质量浓度为30 g/L、KH₂PO₄质量浓度为1 g/L时,对类球红细菌生长和辅酶Q₁₀合成均有利,且辅酶Q₁₀发酵效价达到了380.1 mg/L,糖转化率12.71 mg/g。在30 L发酵罐上进行发酵放大,结果辅酶Q₁₀产量最高达到3 311 mg/L,较对照组提高了15.4%,糖转化率提高了13.9%,这些发酵过程的生理参数进一步验证了甘蔗糖蜜有利于菌体代谢活力的维持以及辅酶Q₁₀的合成。     

辅酶Q_(10)生产菌株粟酒裂殖酵母原生质体制备和再生研究

研究对辅酶Q10生产菌株粟酒裂殖酵母原生质体制备和再生条件进行了优化,确定了原生质体制备及再生的最佳条件为:茵龄20 h,蜗牛酶浓度2 g/L,酶溶液pH值6.5,酶解温度25℃,酶解时间2 h.通过对粟酒裂殖酵母原生质体制备及再生条件的研究,建立了制备粟酒裂殖酵母原生质体的方法,以期进一步通过原生质体诱变获得辅酶Q10高产菌株.     

应用正交实验研究铜绿假单胞菌原生质体制备与再生

通过对铜绿假单胞菌原生质体制备与再生进行正交实验,探讨各因子对铜绿假单胞菌原生质体制备与再生影响水平,得到铜绿假单胞菌原生质体制备与再生的最优条件:酶解时间 0. 5h,酶浓度 2mg/L,菌龄为 15h 此时原生质体形成率为 80. 5%,再生率为 20. 6%     

刺孢吸水链霉菌与淡紫灰链霉菌原生质体制备条件研究

通过对甘氨酸浓度、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素考察,及正交试验优化,确定了刺孢吸水链霉菌和淡紫灰链霉菌原生质体制备的最佳条件.实验结果表明,刺孢吸水链霉菌最佳原生质体制备条件是：甘氨酸浓度为0.5%,酶解温度28 ℃,溶菌酶浓度为3×10-3 g/mL,酶作用时间60 min;淡紫灰链霉菌：甘氨酸浓度为1.0%,酶解温度32 ℃,溶菌酶浓度4×10-3 g/mL,酶作用时间60min.有效的原生质体保存条件是：-20 ℃,在5 d内,原生质体再生率在15%以上.     

过量表达dxsA提高类球红细菌辅酶Q_(10)产量研究

利用PCR扩增了辅酶Q_(10)生物合成过程中重要酶基因dxsA,并连接到pRKpuf载体获得了过量表达dxsA的表达载体pRKdxsA;利用接合转移技术将表达载体pRKdxsA转移到类球红细菌2.4.1中构建了过量表达dxsA的类球红细菌基因工程菌2.4.1/pRKdxsA.微氧诱导表达后,基因工程菌2.4.1/pRKdxsA辅酶Q_(10)的产量提高了约40%.定量PCR分析表明,基因工程菌2.4.1/pRKdxsA中dxsA mRNA表达水平较对照菌2.4.1/pRKpuf显著上调.抑菌圈试验表明,与对照菌2.4.1/pRKpuf相比,基因工程菌2.4.1/pRKdxsA对H_2O_2更不敏感.研究结论为利用类球红细菌工业化生产天然辅酶Q_(10)提供了技术支持.     

超声波破碎法提取辅酶Q10研究

利用超声波破碎法提取类球红细菌辅酶Q10,通过单因素实验及正交实验,获得最佳工作条件.实验结果表明:超声波器输出功率为195W,每次工作时间/间歇时间为4s/5s,工作总时间为4.5min,处理菌悬液OD600为0.640为最佳工作条件.采用优化后的超声波提取工艺,辅酶Q10提取量可达到1.524 mg/g.     

蒙古口蘑与双孢蘑菇原生质体融合育种研究

以蒙古口蘑和双孢蘑菇为出发菌株,研究了酶浓度、酶解时间、菌龄和渗透压稳定剂、再生培养基等对蒙古口蘑和双孢蘑菇原生质体制备和再生的影响.结果表明,蒙古口蘑原生质体制备和再生的最佳条件是,培养5 d的菌丝体用2.5%(w/w)的溶壁酶酶解4 h,渗透压稳定剂为0.6 mol/L KCl,MB为再生培养基,制备率为7.53×1010个/L,再生率为8.4×10-4;双孢蘑菇原生质体制备和再生的最佳条件是,培养5 d的菌丝体用2%(w/w)的溶壁酶酶解3 h,渗透压稳定剂为0.6 mol/L KCl,PQA为再生培养基,制备率为6.96×1010个/L,再生率为7.4×10-4.对两种菌原生质体的释放过程进行形态观察,均为顶端释放.采用双亲灭活原生质体融合技术对蒙古口蘑和双孢蘑菇原生质体融合进行研究,蒙古口蘑原生质体采用热灭活,65℃处理30 min,灭活率达100%,双孢蘑菇采用紫外灭活,在15 W紫外灯下,距离30 cm,处理20 min,灭活率达100%,两菌株按1∶1混合,以30%PEMG(6 000)为促融剂,融合10 min,融合率为5.6×10-5.经遗传稳定性检验,融合菌株的遗传稳定率为80%,从菌落特征、菌丝形态、菌丝生长量、酯酶、游离全蛋白、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和过氧化物酶等同工酶方面对融合子进行筛选,获得一株具有双亲性状的融合株.     

荨麻青霉(Penicillium urticae)原生质体的制备与再生

对荨麻青霉原生质体的高效制备以及再生方法进行了探索.结果显示荨麻青霉较为适合的原生质体制备及再生条件的组合:菌龄为28 ℃恒温下培养20～22 h,DTT预处理0.5 h,以7 mg/mL的纤维素酶,7 mg/mL蜗牛酶,5 mg/mL溶菌酶为混合酶,0.6 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂,28 ℃恒温酶解3.5 h,PDA高渗双层培养基再生.该组合制备原生质体形成量达到1.59×107～1.89×107/mL,其再生率达到16.24%～19.25%.     

槐耳原生质体制备与再生研究

对槐耳原生质体制备与再生进行了研究,结果表明:槐耳原生质体制备最佳条件是以液体静置培养9d的菌丝体,0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂,在体积质量比2%溶壁酶、1%纤维素酶和1%蜗牛酶作用下,25℃酶解3h,制备率达2.75×106个/mL;再生最佳条件是液体静置培养12d的菌丝体,0.6mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,在2%溶壁酶作用下,35℃酶解2h,再生率为12.7%.     

马鹿花光合和水分生理生态特性的日变化

 为研究马鹿花光合参数的日变化规律及其与空气相对湿度RH、大气CO₂浓度C_a、大气温度T_a、叶温T_l、光合有效辐射PAR、叶面水汽压亏缺VPD等主要影响因子间的关系,使用Li-6400便携式光合测定仪对马鹿花光合作用和水分生理生态特征参数进行测定.结果表明,马鹿花净光合速率P_n的日变化呈双峰型,峰值分别出现在12:00前后和16:00前后,出现"光合午休"现象;蒸腾速率T_r呈单峰型,在16:00达到峰值;水分利用效率WUE呈双峰型,上午高于下午.P_n对PAR、T_a和RH的响应程度不同,但均达到显著水平.马鹿花各参数间存在复杂的相关性,随着蒸腾速率增大,气孔导度增大,胞间CO₂浓度减小,净光合速率升高,且影响马鹿花P_n下降的因素主要是非气孔因素.     

浑善达克沙地C3和C4植物对干旱胁迫响应策略

 选取浑善达克沙地C₃植物羊草(Leymus chinensis)和C₄植物虎尾草(Chloris virgata)为研究对象,进行2种干旱胁迫处理,处理1将植物浇至饱和含水量后,使其自然干旱10d,之后复水至饱和含水量;处理2是在处理1的基础上,每天晚上让植物接受自然的大气凝结水.处理期间测定植物的叶片水势、比叶面积、气孔密度、氮含量及生物量等生理生态指标,探讨干旱胁迫及复水后不同光合功能型植物对干旱胁迫响应策略.研究表明,(1) 干旱胁迫显著降低了虎尾草的叶片水势,大气凝结水没有显著改变其叶片凌晨水势,干旱胁迫第10天时羊草叶片凌晨水势值显著降低,大气凝结水使羊草叶片的水势值保持在正常范围之内;(2) 不同干旱胁迫下,植物比叶面积和气孔密度与处理前相比呈下降趋势,但在复水后恢复到处理前水平;(3) 干旱胁迫显著提高了羊草叶片的氮含量,而虎尾草叶片氮水平变化不显著;(4) 干旱胁迫显著提高了羊草的根冠比,而虎尾草的根冠比影响不大,但干旱胁迫则显著提高了虎尾草的果重比.羊草在干旱胁迫下分配较多的生物量到根系,有利于水分的吸收,从而提高了其抗旱性,而虎尾草则分配较多的生物量到种子,使其不断扩大繁殖群体.     

海藻、甘草配伍组合及其复方海藻玉壶汤的急性毒性实验比较研究

 比较单味海藻组、生甘草组、炙甘草组、海藻与生甘草合煎组、海藻与炙甘草合煎组、海藻玉壶汤(生甘草)组、海藻玉壶汤(炙甘草)组不同组别的小鼠急性毒性,进行单味药、反药组合及含反药组合复方的急性毒性观察与评价,为基于临床的十八反研究提供用药依据.分别制备海藻煎液、生甘草煎液、炙甘草煎液、海藻与生甘草合煎液、海藻与炙甘草合煎液、海藻玉壶汤(生甘草)煎液、海藻玉壶汤(炙甘草)煎液作为不同组别的受试药物,参照小鼠急性毒性试验方法,根据预实验结果,进行单味药、反药组合及含反药组合复方的小鼠急性毒性试验比较研究,试验数据用Bliss法计算半数致死量LD₅₀及LD_50(n),满足LD₅₀条件的海藻组、海藻与生甘草合煎液组、海藻与炙甘草合煎液组给药后连续观察7d,其余各组连续观察28d并记录体重.结果表明,实验各组对小鼠急性毒性强度为：海藻组＞海藻与炙甘草合煎组＞海藻与生甘草合煎组＞炙甘草组＞海藻玉壶汤(炙甘草)组＞海藻玉壶汤(生甘草)组>生甘草组.海藻组LD₅₀值为35.67g·kg^-1·d^-1,海藻与炙甘草合煎组LD₅₀值为44.29g·kg^-1·d^-1,海藻与生甘草合煎组LD₅₀值为50.98g·kg^-1·d^-1,分别相当于临床70kg人每kg体重日用量的145.2倍,182.6倍和211.5倍;在LD_50(n)实验中,炙甘草组连续给药第8天死亡数量达到半数,LD₅₀₍₈₎为70.69g·kg^-1·d^-1,生甘草组LD₅₀₍₁₉₎为82.98g·kg^-1·d^-1, 海藻玉壶汤(生甘草)组LD₅₀₍₇₎为79.24g·kg^-1·d^-1,海藻玉壶汤(炙甘草)组LD₅₀₍₆₎为77.49g·kg^-1·d^-1.由此得出结论：海藻煎液、海藻与炙甘草合煎液属小毒范畴,与文献记载相符.通过反药组合单味及复方的小鼠急性毒性试验比较研究,有利于为进一步锁定毒性物质基础及后续实验展开提供依据,亦也为临床安全用药提供依据.     

西帕依固龈液对IL-1β刺激人牙龈成纤维细胞产生PGE2的影响

 研究不同浓度西帕依固龈液对白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)刺激人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblast,HGF)产生前列腺素E₂(Prostaglandin E₂,PGE₂)水平的影响。采用健康人牙龈组织原代培养的HGF细胞,以1ng/mL的IL-1β作为刺激因子,将HGF细胞按5×10⁴/mL的细胞密度接种到24孔培养板中,每孔200μL的细胞悬液。孵育24h贴壁后,弃原培养液,清洗2次后加药,分组为空白对照组(用含20mL/L的胎牛血清的DMEM培养液),IL-1β组(浓度为1ng/mL),IL-1β+西帕依固龈液组(西帕依固龈液终末浓度分别为12.5、25、50、100、200μg/mL),IL-1β+消炎痛(消炎痛浓度为100ng/mL)。用酶联免疫法测定PGE₂含量,观察不同浓度的西帕依固龈液(分别为12.5、25、50、100、200μg/mL)对HGF培养上清中PGE₂水平的影响。结果显示,5种不同浓度的西帕依固龈液均能显著抑制1ng/mL的IL-1β刺激后HGF产生PGE₂,随着浓度的增加,抑制效果也增加,但5种浓度的西帕依固龈液抑制效果均低于100ng/mL的消炎痛。由此得出,HGF具有合成和分泌PGE₂的功能,IL-1β能有效刺激HGF产生PGE₂;西帕依固龈液对IL-1β刺激HGF合成和分泌PGE₂具有显著抑制作用,其抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性。     

高能球磨法制备MgNb2O6粉体及其陶瓷性能

 采用高能球磨法在800℃保温2h预烧合成MgNb₂O₆粉体,研究了MgNb₂O₆陶瓷的相结构、显微结构和微波介电性能随烧结温度的变化关系。实验结果表明,高能球磨法有效促进MgNb₂O₆粉体的低温合成,降低MgNb₂O₆陶瓷的烧结温度。1220℃保温2h烧结MgNb₂O₆陶瓷,密度为4.80g/cm³,平均粒径为3.5μm,介电常数ε_r为19.7,品质因数(Q·f)为29444GHz的优良微波介电性能,MgNb₂O₆粉体有望成为新一代中温烧结高频微波介质基板材料。     

浑善达克沙地固沙先锋豆科植物的光合特性

 豆科植物木岩黄芪是浑善达克沙地的优势种,也是流动沙丘的先锋种,研究其对沙丘恶劣生境的光合适应性有助于揭示固沙植物的适应性机制,为其在沙地恢复中的充分利用提供理论依据.研究了木岩黄芪的光合特征、资源利用效率、PSII光化学效率以及光合酶活性.结果表明,木岩黄芪的光合速率、水分和氮素利用效率较高,忍受中午强光和高温的能力强,还表现出了显著的高的光饱和点和低的光补偿点,气孔和非气孔调节能力强,属于低耗水型植物;C₄光合酶的活性高,但稳定性碳同位素的测定结果显示木岩黄芪是C₃植物,因此木岩黄芪可能属于C₃和C₄植物的中间类型.C₄光合酶作用下的高羧化效率和高资源利用效率以及固氮优势使得该物种对沙丘的恶劣生境适应性较强.     

微波烧结法制备Fe2O3掺杂0.55PNN-0.45PZT压电陶瓷及性能

 微波烧结是一种新型、高效的陶瓷烧结工艺,具有升温速度快、节能省时、改善微观结构以及降低烧结温度等特点.本文采用微波烧结工艺制备了Fe₂O₃掺杂的0.55Pb(Ni_1/3Nb_2/3)O₃-0.45Pb(Zr_0.3Ti_0.7)O₃(简写为0.55PNN-0.45PZT)压电陶瓷,烧结温度为1200℃、保温时间为2h.利用X射线衍射(X-ray Diffraction,XRD)、扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope, SEM)、阻抗分析仪及铁电分析仪等测试表征方法,研究了Fe₂O₃掺杂对陶瓷的结构、介电以及压电性能的影响.结果表明,所有陶瓷样品均为钙钛矿结构,随着Fe₂O₃掺杂量的增加,压电和介电性能呈先增加后减小趋势.当Fe₂O₃掺杂量为0.8%(质量分数)时,陶瓷达到最优电学性能：压电常数(d₃₃)、平面机电耦合系数(k_p)、相对介电常数(ε_r)和介电损耗(tanδ)分别为d₃₃=520pC/N,k_p=0.51,ε_r=4768,tanδ=0.026.     

保温时间对原位生成Si3N4结合MgO-C耐火材料的性能影响

 以电熔镁砂、Si粉和鳞片石墨为主要原料,木质磺酸钙溶液(1.25g/mL)为结合剂,采用两段保温烧结工艺氮气气氛下低温段1350℃保温2h和高温段1450℃分别保温2、3和4h烧成MgO-C材料.研究了保温时间对MgO-C材料物相组成、显微结构形貌以及常规物理性能的影响.结果表明,当保温时间从2h增长到3h时,试样中的物相组成以及原位生成的α-Si₃N₄和SiC晶须尺寸无明显变化,随着保温时间继续增加到4h,Si单质相消失,晶须尺寸出现明显增长.常规物理性能方面,随着保温时间的增加,试样内部CO_(g)、SiO_(g)生成量不断增加,显气孔率不断增大,体积密度和耐压强度不断下降.     

噬菌体单链抗体导向溶栓剂的构建

Fibrin\|specific antibodies were isolated from a phage\|displayed single\|chain antibody(ScAb) library using affinity selection or panning.DNA shuffling was introduced to realign the specific antibody genes in order to mimic the antibody maturation in vivo. After cloning of shuffling products,a secondary library was constructed,from which the specific antibody against fibrin with higher activity was selected through panning and screening.The fibrin\|specific antibody gene and uPA functional domain gene fragment were joined together,then inserted into expression plasmid pET\|21a.The ScAb/uPA fusion protein was expressed with the induction of IPTG.In substrate S 2444 assay,the uPA activity of the chimera was about 3.1×10 3?IU/mg periplasmic protein of host E.coli .It also kept up the affinity to fibrin.