基因工程菌株产生含人类绒毛膜促性腺激素抗原的研究 Ⅱ.β—galactosidase—hCG聚体蛋白免疫原性

基因工程菌株产生的含人类绒毛膜促性腺激素(hCG)β亚单位C末端36肽的β-半乳糖苷酶杂交蛋白(简称β-galaclosidase-hCG),在未经解聚处理前免疫新西兰种白兔和昆明种小白鼠,其抗血清在免疫双扩散试验和对流免疫电泳中对hCG没有形成沉淀线作用。而此杂交蛋白经解聚处理后,其抗血清与hCG相作用,在对流免疫电泳和免疫双扩散试验中都出现抗原抗体反应的免疫沉淀线。从多种蛋白质解聚系统中,经过反复试验,筛选出对β-galactosidase-hCG杂交蛋白有良好解聚作用的解聚剂为2M脲、0.9MSDS、0.005M巯基乙醇;解聚作用最适温度是60℃,最适时间为40分钟。     

外源性人细胞因子对离体培养的晚孕绒毛组织产生βhCG 的影响

利用体外培养的晚期胎盘绒毛组织,加入重组人白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNFα),放射免疫法测定培养绒毛组织上清液中βhCG质量浓度,免疫组化法检测培养绒毛组织中的βhCG表达.观察外源性细胞因子IL-1、IL-6、TNFα对离体培养的晚孕期绒毛组织产生βhCG的影响,探讨细胞因子与βhCG水平改变的关系.结果表明在离体培养的晚期妊娠绒毛中加入重组细胞因子后,滋养细胞产生βhCG的量增加,尤其在加入较高浓度的rhIL-6、rhTNFα时βhCG的产生量增加更明显.免疫组化染色结果显示: rhIL-1、rhIL-6、rhTNFα处理组滋养细胞βhCG表达的阳性程度均高于对照组.说明在炎性细胞因子的作用下,晚期妊娠滋养细胞产生的βhCG增加.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得抗人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体,以hCG为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到4株分泌抗hCG-β单克隆抗体(McAb)细胞株.酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明,所得抗体均为IgG1,κ型,其腹水效价均可达10-6.     

基因工程菌株产生人类绒毛膜促性腺激素抗原的研究——Ⅰ.β-Galactosidase-hCG的分离纯化与鉴定

通过寡核苷酸合成仪,用化学方法合成相当于hcGβ链C末端36肽基因的片段,成功地克隆到噬菌体载体λgt11中,并在宿主菌株E. coli y_(1089)中得到表达。含λgt11 hCG重组体的E. coli y_(1089)所合成的含人类绒毛膜促性腺激素β链c末36肽的杂交蛋白(下称:β—galactosidase—hCG),通过硫酸铵沉淀、亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可得电泳纯单一色带的β—gaIactosidase—hCG。蛋白质转印(Western Blot)技术证实β—galactasidase—hCG具有hCGβ链c末端36肽的免疫特性。对流免疫电泳和免疫双扩散试验结果表明β—galactosidase—hCG具免疫原性。从一立升培养液的菌体中可分离纯化约3.8毫克的β—galaetosidase—hCG。     

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

重组质粒pPIC9K-pZP3α-hCGβ CTP109～145的构建

目的：为发展多特异性避孕疫苗,制备重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,用基因工程技术构建重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,方法：根据pZP3α全长和hCG 0633CTP109-145编码的DNA序列设计两对引物,通过部分重聚合酶链式反应（overlaping PCR）,扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145片断,克隆到载体质粒pPIC9K中,然后导入大肠杆菌DH5α,用PCR和双酶切反应鉴定重组质粒,并用DNA测序仪对重组质粒测序,结果：3步PCR扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145DNA片段,插入到载体质粒pPIC9K的克隆位点,获得重组pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145表达质粒,测序结果显示插入序列与设计预期完全一致。结论：重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145构建成功,为表达重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,探讨重组多特异性避孕疫苗抗生育效能的研究建立基础。     

天然Aβ寡聚体抗体的制备研究

在本研究中,制备了Aβ寡聚体和交联该寡聚体的亲和层析填料,然后应用亲和层析技术从IVIG中纯化获得了结合Aβ寡聚体的多克隆抗体(antibodies against Aβoligomer,Ab-Aβo),并应用ELISA和Western blot对其进行了鉴定,以MTT实验分析了该抗体对Aβ42诱导的细胞毒性作用的影响.结果表明,纯化获得的Ab-Aβo能特异性地结合体外合成或细胞形成的Aβ寡聚体,并且与Aβ寡聚体的结合活性比IVIG高1000倍,同时该寡聚体抗体能够显著抑制Aβ42诱导的细胞毒性.     

不同免疫程序制备17β—雌二醇抗体的效果比较

比较了皮内多点注射和肌肉注射配合静脉注射两种免疫程序制备１７β－雌二醇抗体的效果。证明采用皮内多点注射的免疫程序，比用肌肉注射配合静脉注射的程序更易产生高滴度的抗体。     

外源激素对南方鲶血清促性腺激素水平的影响

南方鲶l龄幼鱼促性腺激素(GTH)分泌调节研究表明：南方鲶幼鱼GTH的释放受到促性腺激素释放激素(GnRH)和多巴胺(DA)的双重调控．但DA不能抑制基础的GTH释放，而只能抑制GnRH刺激的GTH释放，DA对GTH的释放抑制作用是间接通过GnRH实现的．这与研究过的鲤科鱼类不同．而与研究过的其它鲶形目鱼类相似．注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后南方鲶血清GTH水平上升．hCG促使血液GTH水平升高可能与hCG与非洲鲶促性腺激素抗体具有一定的交叉免疫反应有关．hCG与促黄体释放激素类似物(LHRH-A)结合注射后血清GTH水平也显著高于单独注射hCG或LHRH-A后的血清GTH水平，这种升高可能来源于外源GTH(hCG)和LHRH-A刺激脑垂体分泌的内源GTH。     

The effect of antibody surface packing density on its antigen binding capacity

Following our recent study of the binding of antigen hCG (human chorionic gonadotropin) onto a mouse monoclonal antibody anti-β-hCG immobilized onto the support surface, we report a more recent study of the site-specific recognition of another surface immobilized mouse monoclonal antibody anti-α-hCG by hCG. The two antibodies have similar structures and molecular weights but different site-specific recognition from hCG. They both are used in the fabrication of fertility test immunoassays. Previous study by neutron reflection has indicated the “flat-on” orientation of anti-β-hCG with its Fc and two Fabs lying flat on the support surface. The aim of this work is to determine if there is any measurable difference in hCG binding between the two antibodies that could be attributed to the steric hindrance associated with specific binding sites. The adsorption and hCG binding for anti-α-hCG were made under the surface and in solutions as for anti-β-hCG so that the outcome could be directly compared. The results show that the two antibodies are bound by hCG in an almost identical fashion, suggesting that apart from the site-specific recognition there is no measurable difference in the steric hindrance between the α and β sites.     

牛抗体重链可变区超长CDRH3的形成机制及作用研究进展

牛抗体重链可变区中含有较长的DH基因片段,由其参与形成了超长的CDRH3区域,超长CDRH3区域的形成增加了牛抗体的多样性与亲和力.本文阐述了牛抗体重链可变区超长CDRH3区域的研究现状.牛主要依赖其超长的DH8基因片段形成超长的CDRH3区域,通过CDRH3长度的变化、外切酶的剪切作用及体细胞超突变来形成其抗体的多样性.同时,牛抗体中超长的CDRH3区域通过β折叠与二硫键形成特殊的茎环结构也是抗体多样性形成的全新机制.牛经过免疫能产生针对HIV的泛中和抗体,表明此类超长CDRH3区域的出现可为抗体制备、疫苗开发等方面提供新的思路.     

原癌基因c-jun对大鼠睾丸间质细胞基础状态下和人绒毛膜促性腺激素诱导下睾酮分泌的影响

本研究用c-jun ASODNs拮抗c-jun,用人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导体外培养大鼠间质细胞(Leydig cells,LC)睾酮分泌,用放射免疫方法检测基础状态下和hCG诱导下体外培养的大鼠LC睾酮分泌水平.通过c-jun反义寡脱氧核苷酸(ASODNs)观察c-jun对基础状态下和hCG诱导下大鼠睾丸LC睾酮分泌的影响,探讨原癌基因c-jun对大鼠LC睾酮分泌的作用.实验结果显示c-jun ASODNs呈剂量依赖性地抑制基础状态下和hCG诱导下体外培养的大鼠LC睾酮分泌(P＜O.05).提示c-jun能促进基础状态下和hCG诱导下体外培养的大鼠LC的睾酮分泌.     

拟南芥PP2A B'调节亚基β亚型抗体的制备及鉴定

拟南芥中,蛋白磷酸酶2A(PP2A)B’调节亚基有9个亚型,其中a亚型和β亚型是油菜素内酯(BR)信号通路的正调节子,它们能使转录因子BZR1脱磷酸化.选择β亚型特异的一段多肽P109,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了连有HIS标签和GST标签的融合蛋白HIS-P109和GST-P109.以HIS-P109作为抗原,免疫新西兰兔,获得抗体,然后用GST-P109对抗体进行了亲和纯化.利用此纯化的抗体在不同的拟南芥材料中免疫印迹检测β亚型蛋白的表达,证实制备的抗体能与拟南芥PP2A B '调节亚基β亚型特异性反应,为深入研究PP2A在BR信号转导途径中的功能提供了有力工具.     

拟南芥PP2A B′调节亚基β亚型抗体的制备及鉴定

拟南芥中,蛋白磷酸酶2A(PP2A)B′调节亚基有9个亚型,其中α亚型和β亚型是油菜素内酯(BR)信号通路的正调节子,它们能使转录因子BZR1脱磷酸化.选择β亚型特异的一段多肽P109,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了连有HIS标签和GST标签的融合蛋白HIS-P109和GST-P109.以HIS-P109作为抗原,免疫新西兰兔,获得抗体,然后用GST-P109对抗体进行了亲和纯化.利用此纯化的抗体在不同的拟南芥材料中免疫印迹检测β亚型蛋白的表达,证实制备的抗体能与拟南芥PP2AB′调节亚基β亚型特异性反应,为深入研究PP2A在BR信号转导途径中的功能提供了有力工具.     

国产第一代β—hCG避免疫苗免疫恒河猴的抗体反应？…

用国产第一代ｈＣＧ避免疫苗（以β－ｈＣＧ－ＴＴ为免疫原制备的氢氧化铝吸附制剂）免疫成年雌性恒河猴，评价疫苗在实验猴体内诱发抗ｈＣＧ抗体的能力和免疫安全性。结果显示疫苗能在实验猴诱发抗ｈＣＧ抗体，但抗体滴度较度（峰没度为１：４０００），持续时间较短，加入Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ佐剂免疫能显著增强动物的抗体反应（峰滴度可达１：６４０００），免疫猴对强化免疫有较好的记忆反应。免疫前后各免疫猴血液红细胞数、血红蛋     

人血小板多态性抗原HPA-1a/HPA-1b在CHO细胞中的表达及功能研究

为了在体外研究HPA-1抗原的多态性,同时建立一种更简便灵敏的检测抗HPA-1同种(异型)抗体的方法,将含有HPA-1a和HPA-1b的DNA质粒分别转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)并获得稳定表达β3HPA-1a和β3HPA-1b的细胞株.流式细胞分析结果表明,CHO细胞结合抗HPA-1a同种(异型)抗体的能力与细胞表面β3整合素表达量直接相关.同时,针对HPA-1a表位的单克隆抗体SZ21仅能抑制CHOβ3HPA-1a细胞的粘附,对CHOβ3HPA-1b细胞却没有影响.抗HPA-1a参照血清能阻断CHOβ3HPA-1a细胞的粘附,但对CHOβ3HPA-1b细胞却影响甚微.结果表明,CHO细胞模型可以成功地用来表达并研究HPA-1a的多态性及其抗原特性,同时可以作为用于临床检测抗HPA-1a同种(异型)抗体的一种替代方法.     

抗促黄体激素单克隆抗体的研制：Ⅱ单克隆抗体的纯化及特性鉴定

在建立六株稳定分泌抗促黄体激素(LH)单克隆抗体的杂交瘤细胞株后,用羟基磷灰石(HAP)吸附层折技术从小鼠特异腹水中一步纯化抗LH单克隆抗体,抗体纯度可达85％—90％,在纯化抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱上基本显示IgG一条带,每ml腹水回收IgG量为3.6mg,并保留大部分抗体活性。特性鉴定结果表明,在六种抗体LH单克隆抗体中,AL-02和AL-06两种抗体与促卵泡激素(FSH)不产生交叉反应,是抗LH-β亚单位上的抗原决定簇的:其它四种抗体与FSH产生完全的交叉反应,是抗LH-α亚单位上抗原决定簇的。用測定抗体与抗原相对结合力的方法估算了四种抗LH单克隆抗体的相对亲和力,结果是AL-01抗体相对亲和力提高,其后依次是AL-03,AL-04和AL-02抗体。     

不同免疫程序制备17β－雌二醇抗体的效果比较

比较了皮内多点注射和肌肉注射配合静脉注射两种免疫程序制备１７β－雌二醇抗体的效果。证明采用皮内多点注射的免疫程序，比用肌肉注射配合静脉注射的程序更易产生高滴度的抗体。     

17β雌二醇—6(O—羧甲基)肟—人血清白蛋白结合物的合成

以17β雌二醇为原料合成了17β雌二醇-6(0——甲基)肟人血清白蛋白,其6位碳原子上的氧化采用Corey氧化剂(PCC),得到比目前采用的其它方法更高的产率,原料回收良好,17β—雌二醇与人血清白蛋白的克分子比为33:1。     

一种免疫小鼠制备大量多克隆抗体的新方法

研究了一种用纯抗原免疫小鼠,在抗体产生时注射腹水癌细胞,最后取其腹水(含抗体)的多克隆抗体制备方法,免疫1只小鼠共需免疫抗原60～300μg,可获得15～30mL腹水抗体.此法既适合于大分子质量抗原,也适合于小分子质量抗原.用ELISA、免疫印迹、免疫滴定等方法检测抗体效价、特异性、结合力等,均得到满意的结果.此种抗体在-20或-70℃最少能保持稳定1a以上.