天然酶和仿生材料对O—O键活化的机理及环境学应用研究进展(英文)

近年来,催化氧化去除有机污染物受到越来越多的重视,但是氧气或过氧化氢绿色催化剂的使用因O—O键活化的效率低下而受到限制.本文综述了不同种类氧化酶和加氧酶包括以多铜原子为中心(MCOs,如漆酶)和以卟啉/非卟啉铁为中心(HCOs,如细胞色素P450酶等)的氧化酶和加氧酶的O—O键活化机理.前者活性中心以4个铜原子组成,与其结合的氧气分子通过4电子过程实现O—O键断裂;后者主要以单个铁原子为活性中心,与铁配位的基团及铁的配合状态决定与其结合的氧气或过氧化氢分子中O—O键断裂机理.同时本文也对仿生催化材料在O—O键活化方面的工作进行了综述,其中主要包括对酶催化活性中心的模拟和支撑材料的选择.本综述旨在为O—O键活化的仿生催化剂设计和环境应用提供参考.     

南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析

 从南方红豆杉Taxus wallichiana var.mairei的新鲜嫩叶中提取基因组DNA作为模板,利用三组特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的基因全长。该基因编码区起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,全长1 692 bp;碱基组成为490 A (29.0%),351 C (20.7%),362 G (21.4%)和489 T (28.9%)。将紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列与细胞色素P450基因家族的其它三个成员进行比对,发现它与紫杉烷2α-羟基化酶基因、紫杉烷10β-羟基化酶基因及紫杉烷13α-羟基化酶基因的一致性分别为74%、68%及76%。它们的外显子和内含子的连接区均具保守的GT-AG结构,内含子区的变异性明显高于外显子区。进一步以红豆杉属的13个紫杉烷羟基化酶基因家族成员为对象,利用位点间可变ω(非同义替换率dN和同义替换率dS的比值) 模型对该基因家族的适应性进化进行分析。分支模型、位点模型以及分支－位点模型的分析表明：紫杉烷羟基化酶基因家族的少数分支处于正选择压力下(ω>1),但未检测到正选择位点;而绝大部分位点受强烈的负选择作用(ω<1)。     

脱毛碱性蛋白酶(DHAP)的饱和突变

本实验在同源建模和氨基酸序列比对的基础上, 选取脱毛碱性蛋白酶（DHAP）8个氨基酸位点进行饱和突变. 通过牛奶平板和96孔板发酵筛选, 获得了4个催化特性改良的突变体, 测序鉴定为D248F, D248S, M233L和W214K. 利用酪蛋白和合成肽(AAPL pN)作为底物, 对这些突变体进行了评价, 结果表明D248F、D248S、W214K在常温(28℃)下的酪蛋白水解活性提高; M233L在常温、高温(50℃)的酶活以及热稳定性都有增加. 同时, M233L和W214K在25℃和50℃水解AAPL pN的酶活也分别得到了不同程度的提高.     

嗜麦芽寡养单胞菌菌株间羟基化烟碱类杀虫剂吡虫啉的机制差异

嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788,R551-3和K279a菌株均具有羟基化烟碱类杀虫剂吡虫啉IMI的能力,其中CGMCC1．1788菌株的羟基化能力明显高于其他两个菌株．细胞色素P450酶抑制剂胡椒基丁醚抑制CGMCC1,1788菌株的IMI羟基化活性,但不抑制R551-3和K279a菌株的IMI羟基化活性;黄素单加氧酶抑制剂甲硫咪唑均抑制3个菌株的IMI羟基化活性．上述结果表明在S．maltophilaCGMCC1．1788中存在细胞色素P450和黄素单加氧酶催化的两种IMI羟基化机制．R5513和K279a蛋白组比较分析表明,K279a菌株中没有细胞色素P450酶,其催化的IMI羟基化只有黄素单加氧酶参与．由此可见,不同S．maltophilia菌株中具有不同的IMI羟基化机制．该研究对于了解IMI的羟基化机制有一定的理论意义．     

μη2:η2［Cu2O2］2+和Bis(μoxo)［Cu2O2］2+的密度泛函理论研究

酪氨酸酶是一种能氧化酪氨酸残基为对苯醌的生物活性酶,其活性部位含有双铜核心并参与氧化还原反应.实验证明这两个铜核心易与氧气结合生成两种异构体μη2:η2Cu2O2(Ⅱ)和bis(μ-oxo)Cu2O2(Ⅲ), 且它们具有不同的电子结构和化学性质.用量子化学密度泛函理论对乙(撑)二胺和乙腈配合的μη2:η2Cu2O2(Ⅱ)和bis(μ-oxo)Cu2O2(Ⅲ)进行了理论研究,结果表明该两种异构体能量差别较小,相互转化的势垒较低.μη2:η2Cu2O2(Ⅱ)中的Cu-O主要是离子键,Cu2O2呈“Z"构型     

环己酮单加氧酶的克隆表达及酶学性质分析

为研究鞘氨醇杆菌中环己酮单加氧酶的催化特性,从N.aromaticivorans DSM 12444基因组DNA克隆表达了一个编码环己酮单加氧酶的基因chmo,并分析了该基因产物的酶学性质.该基因全长1650bp,编码550个氨基酸,理论分子量为61.6kDa.将携带此基因的重组质粒pET28a-chmo转入E.coli BL21(DE3)后,获得了62kDa左右的表达产物.重组环己酮单加氧酶(CHMO)能氧化芳香族硫醚及其衍生物、链式硫醚、其他硫醚和酮类等底物,以2-氯乙基苯基硫醚为底物时活力最高(25.65U/mg).CHMO最适反应温度和pH分别为55℃和8.87,倾向于利用NADPH作辅酶.上述结果表明,重组CHMO是一个新型的环己酮单加氧酶,推测其与硫醚及酮类物质的氧化降解有关.     

大黄苷元对大鼠药物代谢酶CYP2A6、CYP3A4活性的影响

研究大黄苷元对大鼠体内药物代谢酶CYP2A6、CYP3A4活性的影响,以预测大黄与临床常用药物的相互作用.大鼠分组,分别灌胃不同质量浓度大黄苷元、质量分数0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、苯巴比妥钠(PB)、地塞米松(DEX)、β-奈黄酮(β-NF)和酮康唑(KET),取各给药组给药后24 h的肝微粒体(RLM)与CYP2A6、CYP3A4的探针底物香豆素、睾酮进行体外温孵,通过高效液相色谱法分别测定各底物的代谢产物7-羟基香豆素、6β-羟基睾酮的生成量,考察大黄苷元对CYP2A6、CYP3A4活性的影响.大黄苷元高、中、低剂量给药组代谢产物7-羟基香豆素的生成量高于空白给药组和KET给药组,均有统计学意义(P0.05)、(P0.01),大黄苷元高剂量给药组代谢产物6β-羟基睾酮的生成量高于空白给药组和KET给药组,均有统计学意义(P0.05)、(P0.01).随着大黄苷元给药剂量的增加,7-羟基香豆素、6β-羟基睾酮的生成量均随之增加.大黄苷元对CYP2A6、CYP3A4均有诱导作用,并且随着大黄苷元剂量的增加,其对CYP2A6、CYP3A4诱导作用均增强.     

腺苷化酶的研究进展

腺苷化修饰(AMPylation)是一种由腺苷化酶(AMPylators)催化的翻译后修饰.腺苷化酶是一类催化底物蛋白的某些残基侧链共价结合(或去除)一磷酸腺苷(adenosine 5'-monophosphate,AMP)的酶.腺苷化酶主要属于Fido结构域超家族和类DNA聚合酶家族(DNA-polymerase-β-like family).致病菌表达腺苷化酶调控宿主细胞的信号机制,达到利于致病菌繁殖和生存的目的.真核生物中也存在一些腺苷化酶参与感知和调控细胞应激.从腺苷化酶的分类、催化机理、调控方式和去腺苷化修饰活性等方面综述了腺苷化酶的研究进展.     

荧光分子探针β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ底物的合成

以7-羟基香豆素为原料,经甲酰化后制得8-甲酰基-4-甲基伞形酮(2);2与D-葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖进行取代、氟代及醇解反应后,分别合成了荧光分子探针β-1,4-GalTⅠ的两个特异性底物,即8-二氟甲基-7-羟基香豆素-β-D-葡萄糖苷(7)和8-二氟甲基-7-羟基香豆素-β-乙酰氨基葡萄糖苷(8);其结构经~1H-NMR,~(13)C-NMR和ESI-MS确证.     

细胞色素P450酶生物转化及新催化反应的最新进展

细胞色素P450酶(P450s或CYPs)是一类广泛存在于生命体中,依赖于亚铁血红素催化多种底物的单加氧酶。一方面,它涉及许多高活性天然产物生物合成的关键步骤,对其生物转化研究有助于提高活性分子的产率和活性;另一方面,其催化涉及金属元素以及辅助因子,其蛋白质改造和新催化反应的研发也不断取得新突破。本文就细胞色素P450酶这两方面的最近研究进展进行了总结与论述。     

双核铜配合物[Cu2（Ophen）2]·2H2O（HOphen=2-羟基-1,10-啉菲咯啉）的水热合成和晶体结构

通过水热合成法制备了带有两个游离水分子的羟基化邻菲咯啉双核铜配合物[Cu2(Ophen)2]·2H2O(HOphen=2-羟基-1,10-啉菲咯啉).通过红外光谱和X射线单晶衍射进行结构表征.结果表明标题化合物属正交晶系,晶胞参数为:a=0.384 2(5) nm, b=1.913(3) nm, c=2.691(3) nm, α＝β＝γ＝90.00°, 晶体的其他参数为:Z=2, V=1.978(4) nm3, Dc=1.344 mg/m3, R1=0.083 9,wR1=0.147 1.该化合物中,配体邻菲咯啉发生了羟基化反应,形成羟基化邻菲咯啉,结构中还含有两个游离水分子.芳环之间的π-π堆积作用、铜-铜之间的弱作用使得该化合物分子形成一维梯形结构.     

青霉素酰化酶研究——Ⅱ.酶的修饰和修饰酶的性质

本文介绍用β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)活化右旋糖酐T2000以修饰大肠杆菌5852青霉素酰化酶。活化时500mg右旋糖酐需SESA 20mg。制备对氨基苯磺酰乙基葡聚糖(ABSE)-右旋糖酐的反应温度为80℃,与500mg活化右旋糖酐偶联的酰化酶酶量为100u,修饰率达88.3%。用琼脂糖(Sepharose 4B)或交联葡聚糖(Sephadex G150)柱层析分离得高分子量的修饰酶。修饰酶对热和pH的稳定性均优于自由酶,最适温度提高,但最适pH和高浓度青霉素G底物抑制现象没有改变。     

土壤氧化铁的活化与环境意义

综述了土壤氧化铁的形态和土壤氧化铁活化的主要途径:渍水条件下氧化铁的还原、有机质活化、氧化铁表面羟基化和质子化及耕作方式和细菌等的作用.因活化后的氧化铁具有巨大的比表面积和很强的表面化学活性,能吸附众多的重金属(如镉、铜、锌、铅)、非金属(如氟、硒)和含氧阴离子(如磷酸盐),对于控制土壤中环境污染物的迁移和转化是十分有意义的.     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

多酚氧化酶催化儿茶酚的动力学及机理研究

本研究采用冷丙酮二次提取法从马铃薯中提取出多酚氧化酶,用微量呼吸仪和氧电极测定酶的最适 pH 为7,最适反应温度为25℃。通过对多酚氧化酶活性中心的测定和探讨,认为活性中心起催化作用的是二价铜(Ⅱ),两个铜离子(Ⅱ)之间的距离与儿茶酚两个羟基间的距离一致。双底物动力学结果证明,反应是以氧首先进攻酶的活性中心的强制有序三元复合物的机理。本文还用最小二乘方法回归出了动力学常数,求出了反应的活化能等重要的动力学参数。     

紫红红球菌9α–羟化酶loop对酶活性的影响

3–甾酮–9α–羟化酶是转化雄甾–4–烯–3,17–二酮生成9α–羟基雄甾–4–烯–3,17–二酮的关键酶,其加氧酶组分在底物进入酶活性中心入口处,存在一个由16个氨基酸构成的柔性loop.为了明晰loop对酶活性的影响,利用定点突变技术对loop上结构变化较大的氨基酸进行研究,解析出了各氨基酸的作用,T224、N225、Y226与周围α5螺旋和β折叠存在一定相互作用,共同调节底物通道与底物运送能力;D227和D228起到支撑固定loop结构的作用,使T224–Y226能与其周围的氨基酸产生相互作用.这为进一步采用蛋白质工程改造9α–羟化酶提供了理论依据.     

钯催化的串联环化反应构建β-内酰胺化合物

以N-(8-喹啉基)丙酰胺和取代碘苯为原料,通过钯催化的碳氢键活化与分子内胺化直接有效地合成β-内酰胺化合物.五氟碘苯在分子内关环形成C-N键的过程中起着非常重要的作用.在优化反应下研究底物适用范围发现,带不同给电子和吸电子取代基团的碘苯都能较好地发生反应,以低到中等的收率获得目标化合物.此串联环化反应的发现对快速构建β-内酰胺化合物具有一定的参考价值.     

裂解多糖单加氧酶纳米花固定化研究

本文利用新型无机晶体复合物磷酸铜作为载体，对裂解多糖单加氧酶cx-LPMO-B进行固定化，研究其固定化过程的最适条件，并对游离酶及固定化酶的酶学性质进行对比。结果显示：在搅拌条件下，向含有裂解多糖单加氧酶pH=7.4 0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液中滴加硫酸铜，可形成酶-磷酸铜纳米花，即cx-LPMO-B-NF;在25℃、14 h、酶含量为0.3 g/L条件下制备得到的cx-LPMO-B-NF活性最高，固定化酶重复使用6次后仍能保持60%以上的酶活；扫描电子显微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)发现cx-LPMO-B-NF结构呈现分散均匀且单一的盛开花朵状；固定化酶最适反应pH=4.0,最适反应温度50℃。固定化酶重复使用性显著增强，花状结构增加了其表面积，更加有利于对游离酶的固定化，反应条件较温和使其具有较高的工业化应用前景。     

细胞色素P450蛋白酶对花生四烯酸羟基化和环氧化的理论研究

花生四烯酸是人体内重要不饱和脂肪酸,它的代谢产物对人体具有重要的生理功能.细胞色素P450酶作为人体内重要的一种氧化还原酶,它能够代谢花生四烯酸产生羟基二十碳四烯酸(HETE)和表氧二十碳三烯酸(EET).通过量子化学中的密度泛函方法能够从原子水平上研究P450酶对花生四烯酸的催化过程.结果表明,P450酶羟基化花生四烯酸包括氢提取和回弹的两个步骤.氢提取是整个反应的决速步骤,而且羟基化的过程在两种自旋态下都可以进行.P450酶环氧化花生四烯酸的过程只通过一个过渡态就得到产物,从能量角度上看,低自旋态的反应更容易进行.     

双—N(2-羟基乙基)β-雷锁醛亚胺合镍(Ⅱ)、铜(Ⅱ)的合成及其抗癌活性的研究

本文报导了双—N(2—羟基乙基)β—雷锁醛亚胺合镍(Ⅱ)和双—N(2—羟基乙基)β—雷锁醛亚胺合铜(Ⅱ)的合成,它们的组成已由元素分析和红外光谱所证实。抗癌活性试验表明,双—N(2—羟基乙基)β—雷锁醛亚胺合镍(Ⅱ)对肿瘤模型S_(180)(A)及艾氏腹水癌均有较好的抑制作用.