菜蛾科小菜蛾(Plutella xylostella)细胞系的建立

第一株小菜蛾(Plutella xylostella)蛹发展起来的细胞系已经建成并命名为BCIRL-PX2-HNU3.BCIRL-PX2-HNU3是由20个剪碎的全蛹经过消化处理,培养在TC-199-MK 培养基中建立起来的.原代培养只历时48天就开始了第一次转代,由于细胞增殖快而稳定、此后即按1∶2的分裂比值,每周转代三次,待转代100次后,改按1∶10的比值转代,每周一次,至目前为止,该细胞已传至115代.BC1RL-PX2-HNU3细胞仅疏松贴附瓶壁,容易从瓶壁脱落.转代时,不需用消化酶.细胞的形状多种多样,但以园形和卵园形为主.28℃时,96小时细胞群体倍增时间为30小时±2.06.1×10~5/毫升细胞培养8天后,最大密度可达1.3×10~6细胞/毫升.该细胞系细胞的染色体粗短,多为多倍体,具有鳞翅目昆虫染色体的典型性状.用磷酸葡萄糖异构酶作等电聚焦,该细胞系与一些其他细胞系有明显差异.试验表明:BC1RL-PX2-HNU3细胞系对苜蓿尺蠖(Autographa californica)的核型多角体病毒以及中国棉铃虫(Heliothis armigera)病毒VHA—273敏感,并能复制出多角体.另外,用小菜蛾颗粒体病毒感染该细胞系,6天后,电镜切片证实培养的细胞胞质内出现了颗粒体病毒的蒴伏体,但在随后的多次试验中,未能重复.     

斑节对虾肝胰腺和血淋巴组织细胞的体外培养

用斑节对虾(Penaeusmonodon)的肝胰腺组织及血淋巴细胞进行了体外培养,结果表明肝胰腺细胞培养共传3代,促肝细胞生长因子效果不明显．血淋巴细胞原代培养很成功,血淋巴细胞90％多为贴壁生长,其中圆形悬浮生长细胞可见分裂相,少数瓶细胞传代6次,生长时间达半年之久,加入PHA后,对细胞没有明显刺激作用．     

原代HUVECs分离培养关键影响因素分析

内皮细胞与心脑血管病变和癌症发生密切相关,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)是最佳的研究工具.针对影响原代HUVECs培养的主要因素提出解决办法,建立稳定可靠的原代HUVECs培养方法.方法是取自剖宫产手术的脐带,消化法分离HUVECs,M199培养传代.针对消化条件、培养液、培养瓶/板处理、传代时间、胰酶浓度等因素考察.结果表明培养瓶/板预先2%明胶包被,采用I型胶原酶分离消化,含10%胎牛血清的M199培养,24h后换液,细胞生长至紧密后传代,O.05%胰酶传代消化,取4～5代细胞用于实验.认为经过控制原代HUVECs培养的主要影响因素,建立了不易污染、纯活度高的原代HUVECs培养方法.     

棉铃虫(Heliothis armigera)的细胞培养

用Grace(1962)培养基,辅之以10—20%小牛血清,对棉铃虫蛹及成虫的生殖腺细胞,胚眙细胞,幼虫的血细胞,脂肪体及体壁细胞进行培养,并对其生长进行比较,发现在上述的培养中,以初羽化成虫的即巢细胞生长最好,维持的时间也最长,生长良好的卵巢细胞一般在12小时内即可贴附瓶壁,一周内可以长成单层。培养的细胞多兼有成纤维状或园形两种,亦有以上皮样细胞或园形细胞为主的。经过换液,有的培养中出现了成片较小的纺棰形细胞.抽样作分裂相的检查观察,证实了大量细胞处于分裂活动期。细胞在培养中有的存活超过了4个月,其中最长的已达19个月。原代培养的细胞能存活这样长的时间,实属罕见。唯未见这些细胞有什么变化,也看不到有增殖的迹象.全部培养都没有以昆虫血淋巴作培养基的辅助物.     

蓖麻蚕蛹卵巢细胞株的建立及其对核型多角体病毒敏感性…

用蓖麻蚕雌蛹卵巢组织进行离体细胞培养，建立了细胞株，命名为ＷＶＢ－Ｐｃｒ－０２，在建株过程中，原代培养一个月左右，就开始传代。细胞生长稳定，分裂比值为１：２，每４－５ｄ传代一次。细胞主要为贴壁的圆形细胞，其次是梭形细胞。细胞群体倍增时间为６０－６４ｈ。观察细胞染色体，其二倍体蚕的染色体为５６条，建株后染色体数为１００－１１０条，与其他蚕细胞类似。     

乌龟脑和肝组织细胞的体外培养

以乌龟脑和肝组织为材料,用φ=20%胎牛血清的DMEM培养液进行体外培养,同时也对肾、心肌、脾脏、尾部肌肉等组织进行了体外培养,结果表明:原代培养的脑细胞(TBCs)和肝细胞(TLCs)生长良好,传代TBCs前3代生长稳定,第4代出现聚集生长,第5代出现"自发转化"现象,至12代,"转化"后的细胞体系生长旺盛;TLCs传代后不易增殖,第3代出现衰退;肾脏细胞在培养过程中有少量贴壁;心肌、脾脏、尾部肌肉的细胞培养都不成功。     

原代和传代培养的人输卵管上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响

体内精卵结合、早期胚胎发育是在输卵管中进行,人们将配子、早期胚胎进行输卵管内移植（GIFT、TET）,发现胚胎发育率和妊娠率都提高。体外模仿输卵管内环境的最好方法是将胚胎与输卵管上皮细胞或组织共培养。本实验用已建立的原代和传代培养的人输卵管上皮细胞分别与小鼠早期胚胎共培养,观察其对早胚发育的影响。胚胎与不同培养时间的人输卵管壶腹部上皮细胞共培养的发育状况见表1。表1人输卵管上皮细胞对小鼠胚胎发育的影响P：原代培养第5－6d细胞;S1－S5：传代1－5代培养第4－5d细胞;T2、T4：传代第2和第4代培养第id细胞,设此…     

大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定

探讨体外大鼠半月板纤维软骨细胞分离培养与鉴定的实验方法,观察不同代次间细胞的形态学特征.手术分离大鼠双膝内外侧半月板,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化法提取细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞,低糖DMEM完全培养液常规培养.结果表明,原代半月板细胞形态呈多角形,轮廓清晰,8～10d可铺满瓶底;传代后的1～3代细胞,其贴壁及增殖能力加强,生长状态良好;传至4～5代尤其是第5代之后,细胞表型不稳定,密度稀疏,形态以长梭形为主且不规则,清晰度下降,传代周期延长;细胞鉴定结果呈阳性.双酶消化和低糖DMEM完全培养液常规培养可以获得具有良好生物学特性的半月板细胞,第4代之前的半月板细胞可以为运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.     

兔成骨细胞的体外培养及生物学行为观察

以一月龄幼兔的颅顶骨为材料 ,采用组织块法 ,进行细胞的原代培养并传代之 .结果显示 :(1)原代细胞具有成骨细胞的形态特征 ,经 6次传代后细胞形态变化不明显 ;(2 )细胞具有较强的碱性磷酸酶 (AL P)活性且稳中有升 ;(3)细胞培养液和细胞内均含有骨钙素 ;(4)连续培养 1个月后 ,成骨细胞有矿化结节形成 ;(5 )骨片经 4次贴壁仍有细胞爬出且细胞形态相同 .该结果表明所培养的细胞具有成骨细胞的生物学行为 ,为骨细胞生物学和骨组织工程的研究提供了一种客观而有效的手段     

鹿茸组织和细胞原代培养和继代培养研究

本文对鹿茸皮肤及肉质部分组织块的培养及继代培养方法、从鹿茸各组织中分离细胞的方法及分离细胞的原代培养和继代培养进行了研究。由鹿茸皮肤细胞建立的细胞系已在体外培养了近四个月,传至第三十代,由鹿茸的肉质部分建立的细胞系已在体外传了二十几代。传代工作仍在继续。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离与体外培养

研究了昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离、培养和生长特征,建立了快速、稳定的优质饲养层细胞培养体系.从不同日龄的胎鼠均分离到胚胎成纤维细胞,但最佳分离时间为13.5~14.5d;三种分离原代胚胎成纤维细胞的方法中胰酶消化法效果最好,能在较短的周期内获得大量原代及传代细胞;MEF细胞形态以小梭形为主,呈漩涡状、火焰状生长;增殖速度较快,每1~2d可传一代,按1∶3比例常规传代;5代以内适宜制作饲养层用,5代以后细胞开始变形呈现典型的衰老特征.     

培养原代小鼠组织细胞检验细胞实验室技术操作规程

目的通过培养小鼠原代组织细胞,检验本科室己建立的一套细胞实验室技术操作规程能否满足细胞培养要求。方法培养小鼠原代成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞和胚胎成纤维细胞。计算原代培养成活率、传代成活率、冷冻及复苏成活率。结果成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞、胚胎成纤维细胞原代培养成活率分别为89%、96%、100%、100%、100%、80%、100%和90%;传代成活率分别为76%、93%、100%、92%、100%、66%、80%和92%;冷冻及复苏成活率分别为100%、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%。结论通过计算KM小鼠8种组织细胞原代培养、传代、冷冻与复苏的成活率,证明现有的细胞室技术操作规程基本上能够保证成功培养出常规原代细胞,并能传代、冷冻和复苏。     

兔心房来源非心肌细胞的分离培养

建立一种兔心房组织来源的非心肌细胞体外培养模型,为心血管药理实验、病毒学实验及组织工程的研究提供实验平台.无菌条件下取兔心房壁组织,将组织分离成2 mm×1 mm小块,采用植块法以5行4列的形式种植于培养瓶中,加入M199或MEM培养基对兔心房组织进行原代培养.待长成单层时胰酶消化收集细胞,并进行传代培养和细胞冻存.该方法获得了大量活力良好的兔心房壁组织来源的非心肌细胞,倒置镜下观察细胞多呈短梭形,以及少量的三角形、柱形和卵圆形细胞,细胞核部位隆突,胞浆均匀清亮.经体外传代培养至16代,冷冻复苏以后,细胞仍生长良好.     

外源RNA对小鼠成纤维细胞形态和蛋白质表达的影响

用不同RNA诱导培养小鼠成纤维细胞 ,观察外源RNA对细胞形态的影响 ,发现所添加的不同RNA均可使细胞形态发生改变。将形态改变的细胞传代 ,发现改变的细胞形态可维持至第 3代。将大鼠肝RNA诱导的小鼠成纤维细胞传代至第 4代 ,每代留样做蛋白质SDS PAGE电泳 ,观察RNA对蛋白质表达的影响 ,发现RNA诱导的细胞 ,1— 4代蛋白表达均发生了质和量的改变。     

谈谈细胞的传代培养

细胞传代培养是组织培养中一项重要的工作。组织培养包括组织、器官和细胞的培养。由于细胞培养比组织和器官培养应用广泛,所以讲组织培养主要是指细胞培养。细胞培养包括由培养的组织块发展成单层细胞、制备原代细胞培育成单层细胞、原代细胞的再培养、建立细胞株、细胞系等五个方面内容。前两者都是新制备培育的细胞,后三者则是靠细胞传代而得到大量细胞。细胞传代比起新制备的细胞有很多优点,如可节     

棉铃虫多粒包埋核型多角体病毒在传代细胞系中的复制

VHA-273和HA-MEV是两个不同来源的中国棉铃虫多粒包埋核型多角体病毒毒株。前者是从我国湖北省荆州地区获得。后者最初来自苏联。为了探寻对这些病毒敏感的细胞系,建立起较优的病毒——细胞体系,用这两个毒株分别感染了七种鳞翅目昆虫的八个细胞系。这些细胞是中国棉铃虫(Heliothis armigera)的BCIRL-HA-AM1、美国棉铃虫(H.zea)的BCIRL—HZ—AM3、烟夜蛾(H.virescens)的BCIRL—HV—AM2、黄条行军虫(Spodoptera ornithogalle)的BCIRL—SO3—HNU1与BCIRL—SO4—HNU2、草地贪夜蛾(S.frugiperda)的IPLB—SF—21、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TN—368(CLI)和小菜蛾。(Plutella xylostella)的BCIRL—PX2—HNU3。此外还用VHA—273感染过另一种实夜蛾(H.Subflexa)的BCIRL—HS4—HNU4。病毒接种物包括稀释的病虫血淋巴以及具有感染性的细胞培养基。不论是病虫血淋巴或具有感染性的培养基都能使敏感细胞受染。病毒的复制以培养的细胞在细胞核中出现病毒多角体为标准。发展最快的,在接毒后三天,核内即可见到多角体,但大多数在一周左右。试验结果表明:对VHA—273敏感的包括粉纹夜蛾、草地贪夜蛾和小菜蛾的三种细胞系,对HA—MEV敏感的有草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的二种细胞系。其他各种受试细胞对这些毒株敏感性很低或不敏感。将已复制多角体后的细胞用超声细胞破碎器处理以释出多角体,三次重复计数的结果为:VHA—273在粉纹夜蛾、草地贪夜蛾、小菜蛾细胞内复制量分别为13×10~5PIB_s/ml、11×10~5PIB_s/ml、2.7×10~5PIB_s/ml;HA—MEV在草地贪夜蛾、粉纹夜蛾细胞内复制的量分别为3.8×10~5PIB_s/ml、3.5×10~5PIB_s/ml。用细胞培养复制出的病毒多角体稀释成不向浓度,感染对本病毒敏感的美国棉铃虫的初孵幼虫,每种浓度试验用虫25—50头,其致死中浓度为VHA—273:830PIB_s/cm~2,HA—MEV:478PIB_s/cm~2。当浓度为1000PIB_s/cm~2时,VHA—273与HA—MEV感染幼虫的死亡率分别为74%和82%,浓度为5000PIB_s/cm~2时,其死亡率均达92%。     

草鱼前体脂肪细胞原代、传代培养及鉴定

建立草鱼(Ctenopharyngodon idellus)前体脂肪细胞的培养体系,体外重现草鱼脂肪细胞的增殖分化过程.实验采用油红0染色法对脂肪细胞进行鉴定;采用倒置显微镜(NIKON)和CCD对细胞进行观察摄像;选用的健康草鱼体重为800～900 g;利用体外组织培养技术在温度为28℃,CO2浓度为5%,血清浓度为20%,pH值为7.0～7.2的条件下,以DMEM/F12培养基对来源于草鱼腹腔的脂肪组织进行原代培养;单层的原代培养细胞达到瓶底面积的70%～80%且汇合时.对细胞进行传代培养.研究发现在本实验条件下,培养48 h后组织块周围有梭形细胞迁出;3 d后细胞数量增多,多为梭形和多边形;培养8 d后大部分细胞融合;细胞内脂滴可被亲脂的油红0着色,证明为脂肪细胞.对融合后的细胞进行传代培养,可传至第4代;传代第3 d可形成致密单层;第8 d胞质内含有大量脂滴.研究初步确立了较为适宜的草鱼前体脂肪细胞离体培养体系.     

牦牛心脏原代成纤维细胞系的建立及鉴定

旨在建立牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系并对其进行鉴定.以牦牛胚胎心脏组织块为研究对象,运用组织块法对其进行分离培养获得原代细胞,使用胰酶消化法对原代细胞进行传代培养,通过MTT法检测细胞增殖活性,利用HE染色法及秋水仙素处理染色体鉴定细胞外形,选取4个成纤维标志性基因TGF-β、FSP-1、S100A4、Vimentin,通过RT-qPCR技术对基因的表达情况进行鉴定.结果显示成功将原代分离培养的成纤维细胞传代至11代;通过外型的一系列检测方法发现其符合成纤维细胞的外形,该细胞活力充足,生长规律符合“S”型生长曲线;荧光定量检测以上四种成纤维细胞特征性基因在不同代数中均表达且相对稳定,结果证实分离培养出的细胞符合成纤维细胞系的分子表达特征.本研究成功建立了牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系,集成了该细胞系的鉴定流程,为今后牦牛进一步研究提供相关的细胞系平台.     

传代培养对嵌合型非整倍体计数嵌合比例的影响

探讨嵌合型非整倍体样本经传代培养后,对嵌合比例的影响。将两例(21-三体综合征、特纳综合征)嵌合型非整倍体患者外周血样本进行体外培养,72h传代一次,连续传代两次。用原位荧光杂交(FISH)技术检测原代、传代1、传代2样本中嵌合比例的变化情况。嵌合型21-三体综合征异常细胞比例分别为原代(189/200)、传代1(165/200)、传代2(139/200);嵌合型特纳综合征异常细胞比例分别为原代(142/200)、传代1(73/200)、传代2(55/200)。嵌合型非整倍体样本经传代培养后,异常细胞所占比例逐渐减少,利用传代细胞进行疾病诊断时容易出现漏诊或误诊,原代细胞更适用于疾病的诊断。     

棉钤虫核多角体病毒在离体细胞内的复制

用棉铃虫病毒(VHA—273)感染棉铃虫细胞的原代培养,成功地复制了病毒核多角体. 供感染用的细胞已长成单层,并经过四次换液,病毒接种物是采用病虫的血淋巴. 病毒复制的整个过程进行较快。4—5天即巳完成。多角体的数量也较多. 培养的细胞在接种病毒的第二天,即开始发生病变,此时细胞肿胀,胞核膨大。第三天,核内开始出现大量的多角体,占满了整个胞核,第四天起,部分细胞开始解体,通过镜检,可在培养液内看到许多游离的多角体。