番茄MSI2 like基因的克隆及功能初探

研究通过对番茄MSI2 like蛋白序列与其它模式植物的蛋白序列进行同源性比对, 发现番茄MSI2 like与马铃薯的同源性最高; 另外还预测了其蛋白质的理化性质及三级结构. 酵母双杂交实验证明, MSI2 like与UV Damaged DNA Binding Protein 1(DDB1)具有相互作用. 同时, 利用RNA干涉技术构建植物双元载体, 农杆菌介导法转化番茄得到转基因植株, 该转基因植株在干旱胁迫条件下有一定的抗旱功能. 再利用实时荧光定量PCR分析MSI2 like基因表达的组织差异性, 发现它在各个组织中都表达, 但是在生殖器官花中的表达量明显较其他组织高.     

啤酒花潜隐病毒新疆分离物的全基因组序列分析

对新疆啤酒花上获得的HpLV分离物HpLV-XJ进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示:HpLV-XJ的全基因组序列为8612个核苷酸(nt)(不包括poly A),含有6个开放阅读框(ORF),分别编码224 kDa(ORF1)、25kDa(ORF2)、11 kDa(ORF3)、7 kDa(ORF4)、34 kDa(ORF5)、和12 kDa(ORF6)蛋白。序列相似性分析结果表明,HpLV-XJ与HpLV(GenBank:AB032469)序列相似性达98.5%,6个开放阅读框的核苷酸序列相似性分别为98.3%、99.0%、97.6%、96.7%、99.5%和98.4%;由此推导的氨基酸序列相似性分别为98.6%、98.7%、97.2%、95.0%、99.4%和98.1%,各个基因的核苷酸序列和蛋白的氨基酸之间存在着一定的差异。     

水稻16kDa醇溶蛋白启动子克隆及载体构建

水稻种子16 kDa醇溶蛋白是水稻种子成熟过程中,由16 kDa基因编码,16 kDa醇溶蛋白启动子调控,在胚乳中特异表达的蛋白质.以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到16 kDa启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为931 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.9%.该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Prolamin-box等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件.利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pC16 kDP.     

小龙虾钙结合蛋白基因表达及纯化

从小龙虾(Procambarus clarkii:pc)的肌肉组织中提取其总RNA,设计特异性引物,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆出编码小龙虾钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein:SCP)基因片段,扩增片段为582 bp.该序列与已报道的几类虾SCP序列比对结果表明:在氨基酸水平上同源性为81%～96%.将SCP基因与pET-28a载体连接,构建了原核表达载体pET-28a-peSCP重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为22 kDa,与预期的相对分子质量大小相符.并用Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化,得到了纯度较高的pcSCP.研究重组蛋白peSCP的获得,为pcScP变应原性及相关的研究奠定基础.     

新疆加工番茄上一种类似南方番茄病毒的分子检测

在对加工番茄里格87-5进行RNA测序时,我们发现存在南方番茄病毒的基因组序列,序列包含STV除5′末端12bp和3′末端35bp的其它全部3390bp的RNA序列,其中只有5个碱基存在差异(与EF442780相比),说明里格87-5感染了STV。为了快速检测加工番茄品种的病毒感染情况,我们设计了STV特异性的PCR引物STV168F/STV745R,用一步法RT-PCR方法,从里格87-5的总RNA中扩增得到了预期的577bp的扩增产物,回收、克隆到pGEM-T上,提取质粒经EcoRI酶切鉴定后进行序列测定,与已报道的STV的序列同源性为99%～100%,表明该片段是STV特异性的。运用这项技术调查了20份加工番茄材料,结果显示,有3份材料的全部植株均带毒,13份材料均不带毒,另外4份材料部分带毒。同时,在新疆石河子蔬菜花卉研究所随机采集了加工番茄叶片样品,统计大田检出率约为28%。     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.     

合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础     

中华绒螯蟹内源性白斑综合症病毒基因EjsWSSV的克隆与鉴定(英文)

基于已获得的表达序列标签序列,应用RACE技术从中华绒螯蟹基因组中获得了一个白斑综合症病毒基因(EjsWSSV)的全长cDNA序列,全长为3 864 bp并包含一个3 732 bp的开放阅读框,编码一个138.25 kDa的含1 243个氨基酸的多肽,编码的氨基酸序列包含一个VWA结构域.通过序列比对、序列结构比较和一些生物信息学预测分析,表明EjsWSSV蛋白序列与白斑综合症病毒基因组的ORF16具有高同源性,它不含有信号肽和跨膜区,为非分泌型和α-螺旋型蛋白,可能定位于细胞质.通过PCR检测验证,EjsWSSV基因可能为内源性病毒基因.     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用

CRISPR-Cas系统是新近在原核生物中发现的一种抵御外来DNA入侵的免疫机制,由一个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和附属的蛋白质(Cas)组成,广泛分布于真细菌和古菌中.CRISPR由重复序列及其间隔序列组成,间隔序列来自于过去的入侵DNA,并插入到细菌的CRISPR排列中.一旦出现新的入侵,CRISPR转录,其RNA经过加工后与Cas蛋白质组成一个核蛋白复合体,该复合体通过RNA与入侵DNA序列之间的互补配对,结合目标序列,最后Cas蛋白质将入侵DNA降解.此外,基于CRISPR系统中的Cas9蛋白,发展了一种新的基因组编辑技术,在不同的细胞中均能获得高效的基因定点打靶,展现出巨大的潜力.     

番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

沙田柚S-RNase基因的克隆及序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序。通过差异分析得到沙田柚S-RNase基因序列。该基因全长为1 238bp(GenBank登录号为KP172529),开放阅读框(ORF)全长为834bp,共编码278个氨基酸,编码的蛋白质的相对分子质量为31.402kDa,理论等电点为5.30。S-RNase蛋白为亲水性蛋白,共有17个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与柚Citrus maxima、沙糖桔Citrus reticulata和甜橙Citrus sinensis的同源性分别为99%、98%和96%。系统进化树显示沙田柚S-RNase基因与柚、沙糖桔和甜橙亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.     

日本囊对虾Na-K-2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等技术在鳃组织中获得日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)Na-K-2Cl共同转运蛋白(NKCC)cDNA全序列,包含14bp的5′非编码区(5′-UTR)、201bp的3′-UTR和3 183bp的开放阅读框(ORF).该ORF共编码1 060个氨基酸,预测蛋白分子质量为117.051ku,理论等电点为6.57,命名为Mj-NKCC.预测Mj-NKCC二级结构由10个跨膜区组成,跨膜区的氨基酸序列和布局均相对保守.同源对比结果显示,Mj-NKCC的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾(Halocaridina rubra)的Na-K-2Cl共同转运蛋白相似度最高,为77%.系统进化分析表明Mj-NKCC与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹(Callinectes sapidus)等甲壳动物的NKCC聚为一支.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,Mj-NKCC基因在肝胰腺、鳃、胃、肠、心、眼柄、肌肉和血细胞中均有表达,鳃组织中表达量最高;在盐度骤变时,该基因表达变化显著,表明其很可能参与了对虾的渗透压调节,在对虾的渗透平衡中发挥重要作用.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

簇毛麦(Haynaldia villosa)gibberellin 3β-hydroxylase基因的克隆和序列分析

以簇毛麦(Haynaldia villosa,2n=14,VV)为材料,提取总RNA,以大麦,小麦GA3ox序列设计同源引物,通过RT PCR方法,获得了簇毛麦GA3β-羟化酶(gibberellin 3β-hydroxylase,GA3ox)多基因家族中一个cDNA克隆,暂命名为HvGA3ox.该cDNA全长1206bp,含完整编码区1104 bp,推测该序列编码蛋白含368个氨基酸残基,分子量为40.063 KD,等电点为6.27.预测的氨基酸序列含有双加氧酶的活性结构,在酶活性中心2个Fe离子结合的氨基酸残基非常保守.该序列与小麦、大麦和水稻的GA3氧化酶基因一致性分别为98%、96%、86%.为以后进一步分析HvGA3ox的结构及其与功能关系,〖JP2〗还以簇毛麦总基因组为模板,扩增得到一个1582 bp的克隆,该序列与cDNA序列在外显子部分一致,在478~715 bp和879~1019 bp处分别含238 bp和140 bp的内含子.该基因的克隆为进一步研究该基因的功能和结构奠定了基础.     

胎儿心肌钙蛋白T(cTnT)基因的克隆和序列分析

人心肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)可调节肌丝蛋白的Ca2 浓度,从而调节心脏肌肉收缩的肌钙蛋白复合体组成成分之一.在心力衰竭末期,cTnT再度表达.cTnT的mR-NA水平和其蛋白水平升高与心力衰竭密切相关.从正常流产胎儿心脏提取RNA,通过反转录获得cDNA,再利用PCR方法得到目的基因.序列分析证实,得到的基因是正确而特异的cTnT基因,不同人种的cTnT序列同源性很高,达99%以上.全序列有3个碱基与国外报道序列有差别,所编码氨基酸有2个不同.推测其区别可能是人种的差异或胎儿与成人发育期不同造成的.     

乌鳢β-肌动蛋白cDNA克隆与表达分析

利用RT-PCR技术首次克隆获得了乌鳢(Channa argus)的β-肌动蛋白基因cDNA序列.结果显示,乌鳢β-肌动蛋白的cDNA序列全长1 813bp,包含一个1 125bp的开放阅读框(ORF),共编码375个氨基酸.蛋白序列分析显示,乌鳢β-肌动蛋白的相对分子质量为41.731kDa,等电点PI为5.16,由20种氨基酸组成(甘氨酸数目占比最高为7.73%,色氨酸数目占比最低为1.07%),含有3个actin信号位点.蛋白同源性分析显示,乌鳢β-肌动蛋白与大西洋鲑、虹鳟、莫桑比克罗非鱼的同源性达99%以上,与非洲爪蟾、鸡和人等脊椎动物的同源性达98%以上,表明β-肌动蛋白基因在不同物种之间具有很高的保守性.基于NJ法的β-actin基因系统发育分析显示,乌鳢处于鲈形目和鲑形目鱼类的基部,并没有与鲈形目鱼类聚类为一支,表明乌鳢β-actin基因的进化速率较其他鲈形目鱼类更慢.组织表达分析显示,乌鳢β-actin在检测的11个组织中均有表达,且表达量比较稳定,表明该基因可作为内参选择时的候选基因,可为乌鳢功能基因研究时的内参选择提供参考.     

悦目金蛛丝蛋白TuSp1重复模块特征

针对蜘蛛管状腺丝蛋白(TuSp)结构进行克隆和分析,基于悦目金蛛(Argiope amoena,A.amoena)管状腺总RNA,利用简并引物和巢式聚合酶链反应(PCR)技术克隆AaTuSp1编码基因序列1273bp,其包含3个重复单元,每个重复单元编码176个氨基酸,重复单元之间的序列同源性高达97%以上,且富含丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser),其次是甘氨酸(Gly),组成了一系列PolyT,PolyA,PolyS,SQ和GX模体结构,推测与其独特的力学性能相关.系统进化分析表明,不同于典型蛛丝蛋白MaSp,Flag等,AaTuSp1及近系包卵丝蛋白形成一个独立的进化分支.研究结果为基于TuSp1合成仿生蛛丝提供了新的结构基因蓝图.