短双歧杆菌（Bifidobacterium breve 203）α—D—半乳糖？…

研究发现２５株所试肠道细菌中只有６株双歧杆菌可以利用棉子糖良好生长,并且在棉子糖的诱导下产生α－Ｄ－半乳糖苷酶。９种不同糖中,Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒ－ｉｕｍｂｒｅｖｅ２０３可以利用葡萄糖,半乳糖、果糖、麦芽、糖乳糖、蜜二糖、棉子糖良好生长,但只有蜜二糖和棉子糖诱导Ｄ半乳糖苷酶的产生。１０ｍｍｏｌ／Ｌdisplay structure     

Paenibacillus sp.K1 α-半乳糖苷酶酶学性质

利用CODEHOP PCR和Anchor-ligated PCR方法从类芽孢杆菌Paenibacillus sp.K1中克隆得到一个α-半乳糖苷酶基因aga P1,大小为2 190 bp,同源性分析显示,该基因与其他α-半乳糖苷酶基因的序列相似低,是一个新的α-半乳糖苷酶基因。将aga P1在大肠杆菌Origami B(DE3)中表达并纯化获得Aga P1,酶学性质分析显示:以p NPG为底物时,Aga P1最适反应温度为40℃,最适p H 6.5~10,Km值为0.75 mmol/L,最大反应速率Vmax为1.96μmol·min-1·mg-1。同时Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+和甘油能使α-半乳糖苷酶酶活提高1~3倍,而Cu2+、Zn2+、Fe3+和还原型谷胱甘肽则抑制该酶的活性。SDS-PAGE检测Aga P1蛋白大小约为80 ku,与理论预测值基本一致;Native-PAGE分析表明正常条件下Aga P1蛋白以二聚体或六聚体形式存在。以上结果显示,Paenibacillus sp.K1产生的α-半乳糖苷酶为一个新的低温α-半乳糖苷酶。     

β-半乳糖苷酶诱导条件的研究

从市售不同品牌的普通酸奶中分离出6株乳杆菌,分别编号为YB1、YB2、YB3、YB4、YB5、YB6。通过镜检、革兰氏染色、过氧化氢酶反应、糖发酵反应等初步鉴定为保加利亚乳杆菌。对其一株菌产β-半乳糖苷酶的条件进行优化研究,采用乳糖进行不同浓度的诱导,结果表明当乳糖浓度为1.00%时的诱导效果较好;IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)是一种乳糖类似物,也可诱导菌株产生β-半乳糖苷酶,且其终浓度为0.8mM时的诱导效果较好;对两种诱导剂进行诱导效果的比较,表明应用0.8mM的IPTG可达到最佳诱导效果。     

酵母α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中,重组质粒pRSET-Gal转化至相应的受体菌BL21（DE3)）PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析,在50kD处有一目的分子大小的亮带,裂解细菌后经X-α-Gal的显色底物反应,液体变蓝．试验表明：α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的。     

产热稳定α-半乳糖苷酶菌株的筛选及酶活力的初步研究

利用选择性培养基从发霉的豆粕、豆油工厂周围环境中取样并分离纯化获得一株产热稳定性α-半乳糖苷酶耐热真菌,通过形态学和分子生物学鉴定方法初步鉴定该菌株为分枝犁头霉.研究表明该菌株生长的最适温度和pH值是47℃和7.0,所产酶为胞内酶.酶活研究表明粗酶液的最适温度和pH值分别为68℃和7.0,具有较好的热稳定性.     

产α-半乳糖苷酶乳酸菌的鉴定及其发酵性能研究

从传统乳制品中筛选到2株高产α-半乳糖苷酶的菌株,经菌株形态和生理生化特性鉴定以及16S rRNA基因序列分析,确定为发酵乳酸杆菌和长双歧杆菌,并命名为LB21和KLDS2.0509。同时研究了2株菌在豆乳中的酶活力、产酸性能、棉子糖降解能力和蛋白水解能力。菌株LB21和KLDS2.0509表现出不同的α-半乳糖苷酶活力,其最高酶活力分别为26.8U/mL和31.5U/mL,发酵终点pH分别为5.1和5.0,两者均能有效地降解棉子糖,蛋白水解能力随着发酵时间的增加而增强。     

嗜热芽孢杆菌β-半乳糖苷酶发酵条件研究

以嗜热芽孢杆菌为菌种,研究发酵生产β－半乳糖苷酶的条件。应用均匀设计法优化发酵培养基组成,结果为（ｇ／Ｌ）：乳糖０．５、蛋白胨２．０、牛肉浸膏２．０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１。在温度５５℃、初始ｐＨ７．０、摇床转速２００ｒ／ｍ ｉｎ 和１０％ 接种量条件下,发酵２４ｈ,β－半乳糖苷酶酶活力达１３．２Ｕ／ｍ Ｌ。在乳糖水解反应中,证实该酶能催化转半乳糖苷反应,合成半乳糖低聚糖。     

常现青霉(Penicillium frequentans)β-半乳糖苷酶的纯化及其性质

从常现青霉麸曲中抽提的β-半乳糖苷酶(E.C.32。1.23,亦称乳糖酶)粗制品,经两次硫酸铵盐析沉淀和DEAE纤维素柱层析,纯度提高了近55倍,纯化酶的最适反应温度为62～65℃,最适反应pH为4.0。于pH2.2～8.0放置过夜,酶活性基本稳定。以邻硝基苯酚β-半乳糖苷(ONPG)为底物时该酶的K_m为2.06 mmol/L。Cu~(++),Fe~(++)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对酶活性有明显的抑制作用,Mn~(++)为该酶的激活剂。     

酿酒酵母α-半乳糖苷酶基因重组菌株的表达分析

PCR扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)2个α-半乳糖苷酶基因agl2和agl3,将其分别与表达载体pY-ES2连接,电转化酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)INVScl菌株.从重组菌株提取载体进行单酶切凝胶电泳检测,证实agl2和agl3分别在重组菌株AGL2和AGLs表达.以葡萄糖和棉子糖为碳源培养菌株,2株重组菌的生长速率均显著高于原始菌株,提前8h菌数达到最大,其中以AGL3的生长速率提高较为明显,重组还使菌株在液体培养基由原来的部分絮凝转变为完全游离状.2株重组菌株均不能利用蜜二糖为碳源生长.     

环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶水解乳糖和ONPG的底物特异性

在细菌乳糖酶的菌株筛选过程中发现，OHA与LHA的比值范围 1．3－32．2之间，表明OHA与LHA差异很大，无相关性。对环状芽孢杆菌的乳糖酶研究发现，Na^ 和K^ 能不同程度地促进OHA和LHA；Mg^2 能增强OHA，对LHA却表现出抑制作用。酶作用于ONPG和乳糖的最适pH和温度也存在差异。一定反应体系中，OHA／LHA的值随反应条件的变化而不同，因此用OHA来评价LHA会对酶的实际应用带来很大影响。     

Paenibacillus sp.K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18（lac-）为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06U/mL,高于原始菌株的4.55U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。     

乳酸克鲁维酵母(Kluveromces lactis)β-半乳糖苷酶的稳定性研究

探讨了乳酸克鲁维酵母（Ｋ．Ｌａｃｔｉｃ）β－ 半乳糖苷酶金属离子稳定性和热稳定性．证明某些金属离子对β－半乳糖苷酶具激活作用,另一些金属离子对β－半乳糖苷酶活性影响不大,但是在高浓度的条件下均表现出对酶活性不同程度的抑制作用．Ｃａ２＋ 对酶的抑制可以被磷酸盐、脱脂乳以及Ｍｇ２＋ ,Ｍｎ２＋ 所恢复．Ｋ＋ 单独存在就可以大大地提高酶的热稳定性,Ｍｎ２＋ 可以增加Ｋ＋ 对β－半乳糖苷酶的热稳定性作用,而Ｍｇ２＋ ,Ｍｎ２＋ 和Ｎａ＋ 自身不能提高酶的热稳定性．甘油、脱脂乳均可以提高酶的热稳定性,脱脂乳成分如乳糖、酪蛋白酸钠对酶的热稳定作用有赖于Ｋ＋ 的存在     

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

通过水解活性和转糖基活性筛选, 从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16SrDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829. 综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果, 将其鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）2-37-4-1. 确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18?h;碳源实验证明,该菌株β 半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响, 确定最适反应条件为pH7.5、50mmol/L（磷酸缓冲液）配制的40%乳糖溶液, 55℃反应24h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%, 双糖（包括乳糖和转移二糖）33.02%, 葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.     

发酵乳杆菌β-半乳糖苷酶转糖基活性研究

从传统发酵乳制品中筛选到1株转糖基活性较高的乳杆菌,经16S rDNA菌种鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum, EU621851）K4。以乳糖为底物,研究β-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH、乳糖浓度、反应温度和时间的转糖基活性。结果表明在pH 5.5、乳糖20%、温度50℃条件下反应48h,转糖基活性最高,能生成多种低聚半乳糖。研究发现在低乳糖含量（5%）和pH 5～7范围内都具有明显的转糖基活性。用牛奶为原料进行转糖基能力测定,结果该酶既能降低牛乳中的乳糖含量,又能生成低聚半乳糖。因此,菌株Lb. fermentum K4在乳制品发酵中具有潜在的应用价值。     

Alkalibacterium sp. SL3中α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和性质研究

以大布苏盐碱湖分离菌Alkalibacterium sp. SL3的DNA为模板,利用PCR扩增α-半乳糖苷酶基因(galSL3),构建重组质粒pET-22b-galSL3,转化至大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达重组酶（rGalSL3）. 通过镍柱亲和层析分离纯化重组酶,并对纯化的重组酶进行性质研究. 研究表明,纯酶rGalSL3最适pH值为5.5,最适温度为55℃;该酶在pH值 5.0~10.0保持90%以上的剩余酶活,在50℃有非常好的热稳定性. 在0~1.5mol·L^-1 NaCl溶液中该酶的酶活基本不受影响,在3.0mol·L^-1 NaCl溶液中有很好的稳定性. Pb²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Triton-100和β-mercaptoethanol等对重组酶的活性有明显的促进作用. 该酶水解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷的K_m、v_max和k_cat分别为(2.64±0.02)μmol·mL^-1、(454.55±0.59)μmol·(mg·min)^-1和(347.73±1.27)s^-1. 重组酶可水解蜜二糖和棉籽糖,不能水解瓜尔豆胶.     

1-溴-2,3,6-三-O-乙酰基-4-氯-α-D-半乳糖的合成

以蔗糖为起始原料,经缩水、水解反应制得4-氯-α-D-半乳糖,然后通过乙酰化、溴化反应,制得1-溴-2,3,6-三-O-乙酰基-4-氯-α-D-半乳糖,总收率可达74.0%.本合成方法操作简单、条件温和,收率较高,适合大量制备.     

分子动力学模拟探索乳克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶热变性条件

为了研究乳克鲁维酵母中β-半乳糖苷酶可能的熔解温度,采用分子动力学模拟的方法,分别对4种不同温度条件下(35、50、65、80 ℃)的β-半乳糖苷酶进行了50 ns的计算模拟,分析了酶的构象变化以及酶活性中心的差异。研究在原子水平揭示了β-半乳糖苷酶的温度耐受等关键信息:35 ℃为最适酶活温度,该温度下的β-半乳糖苷酶的整体构象最稳定;该酶在50 ℃时的原子波动性显著增加,表明此温度可能趋近熔解温度临界值;蛋白在大于65 ℃条件下丧失柔性,说明蛋白已经变性;进一步的构象分析发现80 ℃高温会破坏β-D-半乳吡喃糖(GAL)结合位点微环境。     

重组杆状病毒的研究 Ⅰ.含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的粉纹夜蛾核型多角体病毒

以昆虫杆状病毒(Baculovirus)为载体、昆虫虫体和昆虫细胞为受体的基因工程,是目前正在开拓的富有前途的新领域之一.杆状病毒载体系统的优点在于:对外源基因的容量大;病毒基因组能提供一个可插入外源基因而对病毒复制本身不受影响的非必需区(多角体基因),同时提供一个极强的启动子,使植入的外源基因能高效表达;能大规模低成本地饲养寄主昆虫,从而有可能大量获得具有重要经济价值的外源基因表达产     

产转糖基β-半乳糖苷酶菌株F3的鉴定、产酶条件及转糖基活性研究

菌株乃从土壤中筛选得到,具有产生转糖基β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的特性。根据形态观察及18S rDNA序列分析;菌株乃被鉴定为扩张青霉（Penicillumexpansum）。通过单因子试验和正交试验,对菌株乃产生转糖基阻半乳糖苷酶的培养基组成及发酵条件进行了优化。优化后的培养基组成为葡萄糖2％、酵母粉1％、蛋白胨1．5％、氯化钠0．3％。在初始pH6．0,28℃培养40h时,其产酶量为2245．2U／L,比优化前提高约3倍。菌株乃产生的转糖基肛半乳糖苷酶以pH4．5缓冲液配制的30％乳糖为底物,50℃反应24h,低聚半乳糖产量为30．6％,其中80％以上为三糖。     

响应面法优化菌株Serratia proteamaculans sp. L 3产冷活性β-半乳糖苷酶

为了开发工业用酶,在前期菌株筛选的基础上,利用Design-Expert软件,通过Plackett-Bru-man设计与响应面法(RSM)相结合的实验统计方法实现对Serratia proteamaculans sp.L 3菌株产冷β-半乳糖苷酶培养基成分的优化.Plackett-Burman设计筛选出3个显著影响因子:K2HPO4,MgSO4和NaCl,应用中心组合设计和响应面分析确定产酶的最优组合为:K2HPO40.15 g·L-1,MgSO40.50 g·L-1,NaCl 0.76 g·L-1,此时预测的最高A420为0.370 4.经过验证实验,结果表示最佳产酶培养基成分条件下,优化后降解ONPG的能力提高了1.1倍.本研究为微生物β-半乳糖苷酶的后续工业化应用提供理论依据.