circRNA研究进展

环形RNA（circular RNAs,circRNAs）是一类通过反向剪接所形成的闭合环状RNA分子,广泛存在于各种生物细胞中,并且具有结构稳定、表达量丰富以及在不同组织及其不同发育阶段具有表达特异性等特征。circRNAs可以作为miRNA海绵调控m iRNA的表达,通过cis或trans调控其母基因的表达,并参与蛋白的翻译。此外,circRNA在神经发育及相关疾病的发生和发展过程中起着重要的调控作用,有望成为疾病诊断的分子标志物。本文就circRNA的分子特征、形成机制、功能、常用的数据库及其与神经系统疾病的关系做一综述。     

环状RNA在系统性红斑狼疮疾病中的筛选及表达

目的:探讨环状RNA(circRNA)在系统性红斑狼疮疾病(SLE)的表达及在SLE发病机制中的作用.方法:利用CIRCpedia数据库,筛选出候选的SLE相关环状RNA,应用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析SLE患者和健康体检者血浆,筛选出目标环状RNA,再用RT-qPCR对目标环状RNA及其对应基因进行验证,最后对其进行生物信息学分析.结果:荧光定量PCR分析显示SLC15A4基因对应的环状RNA:HSA_CIRCpedia_7637在SLE患者组中明显降低,有统计学差异(P=0.048 1);并验证SLC15A4基因线性RNA(P=0.000 3)和环状RNA HSA_CIRCpedia_7637(P=0.006 9)在SLE患者中均比健康对照者明显降低,有统计学差异.生物信息学分析表明HSA_CIRCpedia_7637比较可能结合的miRNA有11种,包括hsa-miR-638等.结论:SLE患者的环状RNA HSA_CIRCpedia_7637表达下调;HSA_CIRCpedia_7637可能通过竞争性结合hsa-miR-638来参与SLE疾病发生.     

非编码RNA研究进展

多年来,人们已经清楚的认识了一系列结构RNA和调节RNA。最近,由Tuschel,Bartel和Ambro实验室发表的一系列文章里,记述了这些结构RNA和调节RNA外,还包括有许多最近发现的仅由22个核苷酸组成的微小RNA(miRNA)的研究前景。由于这些RNA不编码蛋白质,所以统称为非编码RNA(ncRNA)。最近的研究表明,ncRNA比以前所想像的要丰富和重要的多,它们在转录调节,染色体复制,RNA加工、修饰,mRNA稳定性和翻译,甚至蛋白质降解和转运过程中都起作用。本文就对ncRNA的研究进展和最近发现的miRNA作一简要综述。     

活细胞MicroRNA成像研究进展

综述原位杂交法、级联杂交反应和分子信标成像等基于核酸探针的microRNA(miRNA)成像方法,纳米氧化石墨烯、纳米金和多功能纳米探针等基于纳米颗粒的miRNA成像方法,以及基于荧光素酶的成像和放射性核素成像系统等;比较各种成像方法和系统的优点和不足;提出miRNA作为一类基因簇编码的含有19~25个核苷酸的内源性单链RNA,在转录后水平后沉默特定基因,从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。随着光学成像技术的发展,miRNA利用多通道报告等系统提供的无创性和重复性的实时分析,能增加其在活细胞中表达的机会,miRNA成像策略能更好地研究生物体内的miRNA及其表达产物在人类疾病防治方面的应用。     

小RNA合成技术与小RNA药物研究进展

小RNA是一类长度20～24 nt、通过RNA-RNA相互作用调控目标基因的非编码RNA,其作用靶点广泛,能够多途径调节致病基因表达,已经成为新药研发热点。小RNA药物的研发依赖于RNA原料的获取,为此总结了化学合成、体外转录合成及体内生物合成3种小RNA合成方式,重点介绍了使用si-RNA结合蛋白表达siRNA、rRNA支架、tRNA支架及改良tRNA支架4种小RNA生物合成技术;提出利用杂合tRNA支架以生物发酵的方式能够大规模生产重组小RNA,该方法具有活性高、成本低、带有天然修饰、安全性高等优点,为临床RNA药物原料来源提供了备选方案。此外,归纳了美国食品药品监督管理局批准上市的14种小RNA药物以及当前在研小RNA药物的最新研究进展,分析了小RNA药物所面临的挑战及未来发展方向,以期加深对小RNA合成技术和小RNA药物研究进展的理解。     

两种嗜盐古菌中circRNA的鉴定与特征分析

环形RNA(circRNA)是一类特殊的闭合环状RNA,主要由5’末端和3’末端通过反向剪接的方式共价结合形成.在多细胞动物中,circRNA具有一定的进化保守性和组织特异性.古菌作为生物三大领域之一,大多生活在高温、高盐、低氧等极端环境中.对古菌的研究是认知生命进化不可缺少的一环.目前对于古菌circRNA鉴定及特征并没有系统性的研究.选取了地中海富盐菌和西班牙盐盒菌两种嗜盐古菌为研究对象,利用RNA测序(RNA-seq)技术和生物信息学手段,鉴定出两种古菌中circRNA的存在,并深入分析了circRNA的特点;最后以分子生物学手段,对两种嗜盐古菌中部分circRNAs进行验证.在地中海富盐菌中,检测到67个circRNAs;在西班牙盐盒菌中,检测到133个circRNAs.在这两种嗜盐古菌中,circRNA主要源于16S rRNA、23S rRNA、16S rRNA-23S rRNA和蛋白编码基因序列.     

miRNA与肿瘤发生

肿瘤发生的机制是细胞出现失控性增殖。肿瘤的发生一直被广泛认为是由于一系列癌基因蛋白和抑癌基因蛋白的开放读码框的突变而逐步形成的。随着非编码RNA（ncRNA）的发现，传统观念正被改变。最近的研究表明非编码RNA中的成员miRNA可能对于肿瘤的形成起着重要的调控作用。 miRNA（microRNA）是一类高度保守的非编码RNA（ncRNA），长度一般为19—25nt的单链型RNA（ssRNAs），由60．110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。miRNA与靶mRNA的3’UTR碱基配对，通过抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，在转录后水平使基因产生沉默。越来越多的证据显示由miRNA调节的基因调控机制作为基因表达水平调控的一种重要方式，与肿瘤的发生密切相关。     

microRNA对肿瘤细胞增殖与分化的调控

microRNA(miRNA)是一种长度约为22核苷酸(nt)的非编码RNA,其主要通过碱基互补与靶mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)结合,导致靶mRNA降解或抑制蛋白质的合成,在转录后水平调节基因的表达.miRNA突变、缺失或表达水平的异常会导致生理的异常与疾病的发生,与人类肿瘤疾病密切相关,它具有类似于癌基因或抑癌基因的作用,可参与肿瘤细胞的增殖、分化和细胞凋亡等调控过程.miRNA在肿瘤诊断和治疗方面具有广阔的应用前景.     

小分子RNA家族中的新成员--microRNA

近来,人们在多种生物中发现了一类新的小分子RNA——microRNA(miRNA)．miRNA是20～24nt的单链RNA,在进化上具有高度的保守性,它通过与靶mRNA不完全互补配对,抑制蛋白翻译,调节内源基因表达,在基因调控中扮演了重要的角色．miRNA和siRNA(small interferenceRNA)在生成机制、作用途径等方面关系密切,它们既有区别又相互联系．小分子RNA的研究将是今后分子生物学的研究热点之一．     

MicroRNA特征与功能

通过分析总结现代分子生物学国际前沿microRNA(miRNA)领域的研究文献，整理出miRNA研究的基本脉络和走向。miRNA是一类长度～22nt的非编码小分子RNA，在包括线虫、果绳、家鼠、人体以及拟南芥等生物中普遍存在；它在调节基因转录与表达，调控生物体正常发育等生理过程中扮演重要角色。从比较的角度出发，揭示了miRNA与小干扰RNA在其代谢与功能方面共用某些途径，相互交叉与替代，可能同属一个更广范围的小分子RNA介导的生理调控机制。miRNA的研究可能对新一代基因药物的开发具有深远意义。     

环状RNA hsa_circ_0055176对口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨环状RNA hsa_circ_0055176对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞迁移和侵袭能力的影响.方法:35例口腔鳞状细胞癌患者,用实时荧光PCR检测hsa_circ_0055176在OSCC及相应癌旁组织和OSCC细胞系中表达水平.用慢病毒感染或SiRNA转染SCC25和CAL27细胞,检测环状RNA对OSCC细胞生物学行为的影响.结果:环状RNA hsa_circ_0055176在OSCC组织表达低于癌旁组织(t=4.52,P0.001);在OSCC细胞系表达低于人类角质形成细胞(t_(CAL27)=18.58,t_(SCC9)=12.21,t_(SCC15)=10.11,t_(SCC25)=16.88,P0.001).临床数据分析表明与颈淋巴结转移相关(t=12.28,P0.05).SCC25和CAL27细胞中hsa_circ_0055176表达上调或下调均影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力.结论:环状RNA hsa_circ_0055176在口腔鳞癌低表达可增强口腔鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭能力.     

HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体的构建及其体外转录制备感染性RNA的研究

运用重叠延伸PCR方法对HCV全长基因组cDNANS3和NS5A上的E1202G、T1280I和S2197P进行细胞培养适应性突变,构建含有细胞培养适应性突变的HCV全长基因组cDNA,体外转录制备RNA,脂质体法转染人肝癌细胞Huh-7,以RT-PCR检测HCV正、负链RNA,间接免疫荧光法和Western blot检测细胞内HCVNS3蛋白的表达。结果证明,转染后细胞内可间断检测到HCV正、负链RNA及HCVNS3蛋白的表达,且突变体RNA与未突变的HCVRNA相比,明显具有更高的复制效率和蛋白表达。该研究为后续HCV体外培养体系的研究提供了可在细胞内高效自主复制的HCV病毒模板。     

miRNA作用通路研究

后基因组时代的分子生物学研究需要从整体的角度,系统地阐述基因参与的生物调控过程,已有的通过构建基因调控网络的方式所做的系统生物学研究主要关注于蛋白编码基因之间的相互作用。随着近年来非编码RNA（noncoding RNA）,特别是miRNA研究的深入,显示生物体内存在着广泛的基因转录后调控。本论文通过建立综合蛋白质编码基因与miRNA基因相互作用关系的基因调控网络,分析了人类基因组中涉及miRNA的三类作用模式：（1）宿主基因与内含子miRNA共同作用于另一个蛋白编码基因。（2）miRNA簇中的不同miRNA分别作用于存在着相互作用的两个蛋白编码基因。（3）由两个宿主基因与其各自的内含子miRNA形成双向负调控回路。本研究的结果为进一步认识人类miRNA基因的功能特性提供了重要参考,研究所预测的数据为实验验证提供了依据。     

mRNA二级结构对重组人白血病抑制因子(rhLIF)在大肠杆菌中表达的影响

真细菌中翻译起始效率通常是由翻译起始位点两侧的ｍ ＲＮＡ 区域二级结构的稳定性决定的．这种稳定性与该区域ＲＮＡ 二级结构的发生自由能（ΔＧ０ ）相对应．重组人白血病抑制因子（ｒｈＬＩＦ）为具有诱导白血病细胞分化、调节骨组织的生长代谢、维持胚胎干细胞的基本特征、促进神经元的分化等广泛生物学活性的细胞因子．为了获得高表达的ＬＩＦ蛋白,通过翻译起始区的位点专一突变,把具有优选密码子和能量优势的ｌｉｆ 片段克隆入ｐＪＬＡ５０３ 载体,然后转化至大肠杆菌中表达,得到表达量提高１０ 倍的重组ＬＩＦ蛋白     

mRNA二级结构对重组人白血病抑制因子（rhLIF）在大肠杆菌中表达 …

真细菌中翻译起始效率通常是由翻译起始位点两侧的ｍＲＮＡ区域二级结构的稳定性决定的。这种稳定性与该区域ＲＮＡ二级结构的发生自由能相对应。重组人白细胞病抑制因子为具有诱导白血病细胞分化，调节骨组织的生长代谢，维持胚胎干细胞的基本特征，促进神经元的分化等广泛生物学活性的细胞因子。     

miR-34a靶向调控前列腺癌发生相关基因SIRT1的表达

前列腺癌在我国发达地区发病率迅速升高,化疗耐药是前列腺癌治疗最棘手的阶段,因此基于小RNA的无免疫原性的治疗具有广泛应用前景。研究表明miR-34a具有抑癌作用,而其靶标基因的鉴定鲜有报道。本研究结果显示SIRT1基因的表达存在着转录后基因表达调控机制。miRBase数据库预测显示SIRT1基因3’-UTR序列中存在着19个miRNA的靶标位点。通过系列截断实验及萤光素酶报告系统来鉴定到SIRT1基因3’-UTR区域中的功能miRNA为miR-34a。通过靶标位点的突变及三联体、miRNA的类似物及抑制剂来进一步验证了靶位点的有效性。在前列腺癌细胞DU145和CWR22RV1中存在miR-34a对靶标SIRT1基因的转录后抑制作用。本研究的结果可能为前列腺癌的miR-34a靶向基因治疗提供了理论依据。     

靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的人工miRNA的构建与鉴定

趋化因子CCR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,通过抑制CCR5的表达可以在一定程度上阻断HIV-1的复制进程.miRNA介导的RNA干扰相比经典的siRNA在应用中具有更多的特点.本研究的目的是构建可特异有效靶向CCR5的人工miRNA元件.本研究以CCR5基因序列为模板设计了14个miRNA靶序列,以天然miR-30a为基础骨架通过靶序列区替换构建人工miRNA元件.通过将miRNA表达质粒与携带靶序列区的报告质粒的共转染抑制实验检测不同miRNA的抑制效率,结果显示miCCR-13A具有较好的抑制效率和特异性.进一步将miCCR-13A表达载体转染CCR5阳性的HIV-1受体细胞株TZM-b1,RT-PCR检测显示miCCR-13A可在细胞中获得有效表达,同时应用免疫流式细胞术检测显示在miCCR-13A转染细胞相比对照细胞的CCR5蛋白的检测活性明显降低.进一步的研究显示miCCR-13A在细胞中不会影响细胞活性和干扰素效应相关基因osa1和stat1 mRNA水平,具有良好的特异性.本研究获得的可特异靶向CCR5的人工miRNA元件可为进一步的抗HIV-1研究提供重要基础.     

发夹状核酶G11 突变对体外切割活性的影响

为了研究发夹状核酶结构中G 11 特定核苷酸对于其体外切割活性的影响,用 32 P标记长度为267nt含有乙型肝炎病毒C区pKC的体外转录物作为靶RNA,把合成的G 11 位突变的发夹状核酶基因片段克隆入自剪切核酶载体p1.5内形成pHpRz;利用 32 P标记pHpRz的体外转录物,凝胶电泳进行核酶的鉴定和纯化.把未标记的各种核酶与同位素标记的靶RNA在不同条件下进行切割反应,凝胶电泳,放射自显影分析反应结果.切割结果显示与底物的靶序列完全互补的发夹状核酶具有最高的切割活性,随着与靶序列的互补能力降低发夹状核酶的切割活性逐渐下降,甚至消失.这表明发夹状核酶结构中的G 11 位点对于发夹状核酶的切割活性不是必需的,所以与发夹状核酶的G 11 位点相对应的靶序列的选择不受此位点的限制.     

不同转导方式及载体形式对TALENs在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究

通过同源重组进行小鼠胚胎干细胞基因敲除是目前应用最为广泛的基因敲除技术手段,但同源重组的效率却非常低.TALEs和FokI的剪切结构域融合的TALENs可以实现高效的基因敲除.已有报导表明,TALENs识别位点的DNA序列和长度,及间隔区的长短等条件影响TALENs打靶效率.但外源载体的导入方式及载体的形式(DNA或RNA)是否以及如何影响TALENs的打靶效率还不明确.用不同的转导方式将TALENs导入小鼠胚胎干细胞中,并检测TALENs切割识别位点的效率,实验发现Lipofectamine○R2000转染的TALENs比电转化能更高效地切割目的 DNA位点,而DNA质粒或体外转录的RNA表达的TALENs切割DNA位点的效率相近.数据表明,在应用TALENs进行基因敲除时,有必要选择合适的转导方式以提高突变效率.     

环状RNA Circ-CCND1靶向miR-224-3p/SIRT1轴对食管癌细胞生物学行为影响

为了解环状RNA细胞周期蛋白D1(circ-CCND1)靶向微小RNA(miR)-224-3p/沉默信息调节因子1(SIRT1)轴对食管癌细胞生物学行为的影响.利用q RT-PCR检测食管癌组织和细胞中circ-CCND1、miR-224-3p、SIRT1 m RNA表达水平;生物信息学、双荧光素酶实验、pull down实验、RIP实验验证circ-CCND1、SIRT1与miR-224-3p靶向关系;EdU、CCK-8法测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测SIRT1、Bcl-2、Bax、MMP9蛋白表达.结果表明,circ-CCND1、SIRT1在食管癌组织和细胞表达升高,miR-224-3p表达降低(P<0.05),选择ECa-109细胞进行后续实验;生物信息学、双荧光素酶实验、pull down实验、RIP实验证实circ-CCND1、SIRT1与miR-224-3p存在靶向关系;沉默circ-CCND1或过表达miR-224-3p可显著抑制ECa-109细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡(P<...