固定化里氏木霉制备纤维素酶的研究

采用多孔塑料吸附固定里氏木霉（Trichoderma reesei RutC30)菌丝细胞，以硫酸盐纸浆为底物，重复分批发酵生产纤维素酶，滤纸酶活力可达2.4IU.mL^-1，纤维二糖酶活力为0.2IU.mL^-1，分别是游离细胞发酵的1.6倍和2.2倍，固定化菌丝细胞性状稳定，连续使用40d以上，未见酶活力下降，酶解试验表明，固定化细胞生产的酶液对木质纤维原料具有很高的降解效率，当每克底物的酶用量在滤纸酶活力20IU以上时，酶解得率可达90%以上。     

里氏木霉DWC1纤维素酶的研究

实验对纤维素酶高产菌株里氏木霉ＤＷＣ１的最佳产酶条件进行了研究。且分析了菌株在不同的营养及培养条件下的产酶情况。ＤＷＣ１菌株的最佳液体培养条件如下：温度（２５～２９）℃，初始ｐＨ５．０，发酵时间（５～７）ｄ。在此培养条件下菌株的ＣＭＣ酶活及滤纸酶活可分别达到４８３．３ｍｇ／（ｍｌ·３０ｍｉｎ）和１３６．７ｍｇ／（ｍｌ·ｈ）。     

间歇出酶对里氏木霉产纤维素酶的影响

在分批补料的基础上,采用间歇出酶的方法,对里氏木霉产纤维素酶进行了研究。结果表明:分批补料过程中最佳的补料速度为5.5 g/(L·d),在此条件下产酶第8天滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力达到14.40 U/mL和1.59 U/mL。在分批补料的基础上进行间歇出酶,与对照相比,第4、6、8天出酶模式(模式1)时,总滤纸酶活力提高18.14%; 第4、7天出酶模式(模式2)时,总滤纸酶活力提高17.75%; 第5、8天出酶模式(模式3)时,总滤纸酶活力提高27.35%。研究表明,通过间歇出酶可以有效提高纤维素酶总滤纸酶的活力。     

里氏木霉制备木聚糖酶的产酶历程

以玉米芯木聚糖为原料,里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０为菌种,采用改进的Ｍａｎｄｅｌｓ配方制备木聚糖酶,产酶历程与制备纤维素酶时有较大差异。具体表现在产酶周期短,ｐＨ值基本无下降的趋势,酶液中可溶性蛋白质浓度较低。底物浓度为７ｇ／Ｌ时,木聚糖酶活力达１２５６ＩＵ／ｍＬ,比活力、酶得率及酶产率分别为８１９０ＩＵ／ｍｇ蛋白质、１７９４３ＩＵ／ｇ木聚糖和４１８６．７ＩＵ／Ｌ·ｄ。产酶最终ｐＨ应控制在６～７较为适宜,酶活力最高。ｐＨ超过７．０,酶可能失活。酶解结果表明,木聚糖酶对木聚糖干粉具有很高的降解效率,当每克底物的酶用量为０．１克木聚糖干粉产的酶液量时,酶解得率一般可达９０％左右。     

影响固定化里氏木霉合成纤维素酶的动力学因素

对影响固定化里氏木霉细胞合成纤维素酶的主要动力学进行了研究。以纸浆为主要碳源，采用固定化细胞，在２５０ｍＬ摇瓶中重复分批发酵，结果表明，在一批加料条件下，适宜于固定化细胞产酶的条件是：纸浆浓度１．５％～２．０％，Ｃ／Ｎ为８，培养液的初始ｐＨ值４．０摇瓶转速２００ｒ／ｍｉｎ及２６℃。分批添加纸浆可以减少固体底物对氧气输送和物质扩散等方面造成的不良影响，有利于增加底物的总用量，从而促进纤维素酶的合成，     

控制溶解氧浓度对里氏木霉产纤维素酶的促进作用

通过调节通风量控制溶解氧浓度研究其对里氏木霉产纤维素酶的促进作用.结果表明:当通风量固定为25L/(h·L)时,反应22～40h期间溶解氧浓度过低,0～15h和45h以后溶解氧浓度偏高.45～80h期间气体中CO2含量在0.8%以上,不利于菌丝的生长.调节通风量控制溶解氧浓度,可有效地提高里氏木霉合成纤维素酶的能力,并显著地缩短产酶时间.当溶解氧为20%～30%时,气体中CO2含量降到0.4%左右,菌丝生长代谢快,滤纸酶活从固定通风量时的2.75U/mL增加到3.54U/mL,提高28.7%,产酶酶活最高的时间也从84h缩短到72h.     

纸浆浓度及分批补料对里氏木霉产纤维素酶的影响

研究了摇瓶中不同浓度纸浆为碳源对里氏木霉产纤维素酶的影响.结果表明:最佳的碳源质量浓度为12g/L,在此条件下第3天的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为1.68、0.96和0.28U/mL.总碳源为15g/L下采用分批补料技术可以有效提高里氏木霉分泌纤维素酶.使用起始纸浆浓度为9g/L,第2、3、4天分别加入2g/L纸浆,其第3天的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为2.41、0.72和0.27U/mL,较15g/L纸浆为碳源分批培养滤纸酶活提高1.8倍.     

里氏木霉HC-415菌液体发酵产纤维素酶时形态学变化研究

在30L发酵罐中研究里氏木霉HC-415菌液体发酵产纤维素酶菌体形态学变化时,发现该菌的形态变化可分为4个时期;第Ⅰ期为接种后的0～24h,菌体形态主要呈丝状伸长,较少分枝,产酶基本处于停滞期;第Ⅱ期为24～60h,菌丝体不断伸长,分枝增多,菌体变粗,酶活性增长明显;第Ⅲ期在60～132h,此期菌丝体变粗变短,并出现横隔,分枝顶部生出许多膨大的圆形结节,该期为纤维素酶活力的快速增长期和高峰稳定期;第Ⅳ期为132h后,期间菌丝体呈粗短圆状,仍有许多膨大的结节,但菌体数量逐渐变少,酶活性开始逐步下降.结果表明:里氏木霉液体发酵产纤维素酶时菌体形态与发酵液中的酶活性变化密切相关,形态学特征可作为实际生产中快速调控发酵液成熟度的重要指标。     

里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

未漂硫酸盐针叶木浆的酶促打浆

研究了生物酶对未漂硫酸盐针叶木浆酶促打浆后打浆度和纸浆物理性能的影响,确定了酶促打浆的最佳工艺条件,探讨了BIO-RE100半纤维素酶在最佳打浆工艺下对打浆功耗的影响．研究结果表明,生物酶处理最佳工艺条件是：温度为40℃、酶用量为1000g／t、pH值为6、时间为60min．在此最佳条件下使用生物酶预处理浆料,打浆功耗可以降低33％,纸浆物理性能有所提高．扫描电镜分析结果表明,纤维表面剥蚀程度较大,细纤维化程度有所提高,纸浆纤维切断较少．     

里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及其性质

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐、DEAE-Sephadex A-50和SP-SephadexC-50离子交换色谱等分离纯化技术，从里氏木霉（Trichoderma reesei）RutC-30培养液中分离出木聚糖酶组分，再经SephadexG-100凝胶过滤色谱进一步分离纯化，得到2个纯木聚糖酶组分A组和组分B。经SDS-PAGE鉴定两组分为单带，相对分子质量分别为20300和13500。组分A的最适反应条件为45℃、pH3.0-5.5很稳定，酶解产物主要是低聚木糖，只含少量木糖；组分B的最适反应条件为55℃、pH5.5，酶解产物全部是低聚木糖。     

里氏木霉产酶菌株的选育研究

采用紫外线和亚硝酸联合诱变技术,得到产纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的高产的菌株里氏木霉Y07.试验表明,诱变后菌株的木聚糖酶活由325 U/g,提高到28 500 U/g,相对于出发菌株提高了88倍;纤维素酶活由560 U/g,提高到2600 U/g,相对于出发菌株提高了4.6倍;β-葡聚糖酶活由480 U/g,提高到5500 U/g,相对于出发菌株提高了11.5倍.     

绿色木霉产纤维素酶的提取分离及其性质

绿色木霉９２６液体达发酵终点（６～７ｄ）后，所得纤维素酶中ＣＭＣ酶活最高可达２０Ｕ／ｍｌ，滤纸酶活最高可达５．５Ｕ／ｍｌ．发酵液纤维素酶中ＣＭＣ酶组分经硫酸铵沉淀，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—１００柱层析后可提纯６倍左右．紫外光谱分析表明：纤维素酶及其组分在２８０ｎｍ附近有强的吸收峰；红外光谱分析表明：纤维素酶在Ｏ—Ｈ，Ｎ─Ｈ，Ｃ—Ｎ，Ｃ＝Ｏ有吸收带；ＣＭＣ酶学研究表明，ＣＭＣ酶作用的最适反应ＰＨ为５．０，最适反应温度为６０℃，常温下稳定的ｐＨ范围是４．５～６．０．     

里氏木霉液体发酵选择性合成果胶酶

在摇瓶液体发酵的条件下研究了碳源、氮源、酵母汁和营养盐等因素对里氏木霉选择性合成果胶酶的影响规律,并测定了酶学性质。结果表明:从经济角度考虑宜选用脱汁橘皮粉制备果胶酶;在Mandels营养盐中添加1.0 g/L蛋白胨适合于里氏木霉产果胶酶;以25 g/L脱汁橘皮粉液体发酵48 h,果胶酶活力最高值达到32.6μmol/(min.mL),其中纤维素酶和木聚糖酶的活力被分别控制在0.18、0.63μmol/(min.mL)。该果胶酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃,以16μmol/(min.g)的果胶酶振荡水解10 g/L商品果胶粉50 h,酶解得率达80.3%。高效液相离子色谱的分析结果显示果胶酶的主要水解产物为单体半乳糖醛酸,含量达总水解产物的82.5%以上。     

瑞氏木霉纤维素酶研究进展

瑞氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶酶系全、能分泌到细胞外,是研究得最清楚的产纤维素酶的模式菌株,但是其产生的纤维素酶还不能满足工业化转化纤维素的需要。本文从纤维素酶种类与调控、提高纤维素酶活的方法、标记基因的选择等方面概述瑞氏木霉纤维素酶,分析瑞氏木霉纤维酶研究面临的问题及对策,指出提高β?葡萄糖苷酶的产量和酶活是未来研究工作的重点之一。     

里氏木霉和黑曲霉产酸性木聚糖酶及酶学特性比较

【目的】对黑曲霉和里氏木霉产酸性木聚糖酶的性能及所产粗酶的酶学特性进行分析比较,尤其是考察pH值为4时木聚糖酶酶活力及稳定性,从而确定潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。【方法】将里氏木霉和黑曲霉接种至培养基进行产酶培养,比较分析两者的酸性木聚糖酶、酸性木糖苷酶的酶活力及酶学特性。【结果】黑曲霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(52.36±2.61)U/mL和(0.57±0.01)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为55℃、5.0,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为75℃、5.0;里氏木霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(10.12±0.95)U/mL和(0.32±0.05)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为65℃、6.5,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为65℃、4.5。黑曲霉和里氏木霉的酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,分别为(5.26±0.21)U/mL、(1.72±0.21)U/mL。【结论】黑曲霉所产酸性木聚糖酶明显比里氏木霉的更优良,是潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。     

里氏木霉纤维素酶系的分离及其酶学性质

采用两级超滤、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、CM-Sepharose FF阳离子交换层析和Sephadex G-100凝胶渗透层析等分级纯化步骤,从里氏木霉纤维素酶系中分离纯化得到电泳纯的3个内切葡聚糖酶组分EGⅠ、EGⅡ和EGⅢ,2个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ和CBHⅡ和1个β-葡萄糖苷酶组分,它们对各自底物的比活力分别为176.35、153.96、64.22、16.86、4.82、31.00 IU/mg,米氏常数分别为6.70、8.46、13.22、1.37、3.46、2.20 mg/mL.同一类酶组分的米氏常数Km越大,转换数Kcat越小.分离纯化所得EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、CBHⅠ、CBHⅡ和GB等酶组分的分子量分别为50、46、25、65、58、75 kDa.     

里氏木霉诱导合成木聚糖酶的调控

提出了两种不同用途的木聚糖酶的诱导合成方法。以里氏木霉为产酶菌,经适当处理后的玉米芯可诱导产生含纤维素酶（３．４ＩＵ／ｍＬ）的高活力木聚糖酶（５４．４ＩＵ／ｍＬ）。以混有少量纤维素的粗木聚糖作碳源,通过分批补料及对培养条件的限制性控制里氏木霉可选择性合成木聚糖酶;选择性合成程度与碳源浓度有关,当碳源浓度为１０ｇ／Ｌ时木聚糖酶和纤维素酶活力分别为３５．５ＩＵ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ,两种酶活的比值达１７７．５。     

碳源对里氏木霉β-聚糖酶合成的影响

研究了里氏木霉β-聚糖酶的生物合成,并比较了以玉米芯、纸浆、粗木聚糖为碳源对里氏木霉β-聚糖酶诱导合成的影响。结果表明:里氏木霉以15 g/L的玉米芯为碳源合成β-聚糖酶,培养4 d时滤纸酶活、羧基纤维素(CMC)酶活、纤维二糖酶活和木聚糖酶活分别为1.03 FPIU/mL、0.54、0.08和149.7 IU/mL;以纸浆为碳源,可得到较高纤维素酶活、较低木聚糖酶活的β-聚糖酶;以粗木聚糖为碳源,可制备低纤维素酶活的木聚糖酶,木聚糖酶活与CMC酶活的比值高达785.4,适合于纸浆的生物漂白。     

不同碳源条件下里氏木霉纤维降解酶的蛋白组解析

用双向电泳研究里氏木霉在4种 碳源条件下分泌组中纤维降解酶的分布情况。结果表明:在以甘油或葡萄糖为碳源时仅CBHⅡ、AxeI和BXL 3种纤维降解酶有微量表达。在以纤 维二糖为碳源时检测到较高表达水平的CBHⅠ、CBHⅡ、EGⅠ、EGⅢ、BXL、AxeⅠ和AglⅠ。纤维素纸浆可诱导CBHⅠ、CBHⅡ、EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ 、EGⅣ、ManⅠ、ManⅡ、AxeⅠ、BXL和AglⅠ等11种纤维降解酶的大量表达,表达量总和占总分泌组的61％。纤维素诱导的纤维降解酶组分情况 和纤维二糖条件相似,但表达量和酶活性都有显著上升。