鲨鱼肠蛋白酶活性必需基团的研究

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究灰星鲨（ＭｕｓｔｅｔｕｓＧｒｉｓｅｕｓ）肠蛋白酶的功能基团性质，结果表明：色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基及精氨酸残基均与酶活性有关，而羧基、巯基与酶活性无关。     

锯缘青蟹碱性磷酸酶活性功能团研究

应用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱及荧光发射光谱的变化研究锯缘青蟹碱性磷酸酶的功能基团性质，结果表明：色氨酸的吲哚基团、赖氨酸的ε－氨基、组氨酸咪唑基及精氨酸残基是酶活性必需基团，而巯基与酶活性无关．     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

中华猕猴桃蛋白酶赖氨酸残基的作用

有关中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin,EC 3,4,22,14)催化功能基团的研究表明一个游离巯基,一个组氨酸残基为酶催化活性中心必需基团;色氨酸残基为酶活力表现所必需;羧基似与催化活性有关。迄今尚未见到有关赖氨酸残基作用的报道。本文应用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)修饰动力学方法和光谱分析,进一步探讨了赖氨酸残基与Actinidin催化活性之间的关系。有关酶的分离提纯鉴定及酶活力测定均参照文[4],其它实验条件见图注。     

黄鳝蛋白酶的化学修饰

采用NBS，BrAc，IAC，TNBS，PCMB，PMSF，2-ME7种化学修饰剂及Ca^2 ．Mg^2 ，Na^2 ，K^2 ，Cu^2 等9种金属离子和EDTA试剂对黄鳝蛋白酶进行处理，检测酶活性变化，以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。及金属离子和EDTA对酶活性的影响．实验结果表明；NBS．BrAe，IAC，TNBS，PMSF对酶的抑制作用很强，而PCMB，2-ME对酶活性影响不大。说明色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基和丝氨酸残基的化学修饰对酶的活性影响很大。为酶活性的必需基团。而巯基、二硫键等与酶活性无直接关系．Cu^2 ，Ba^2 对酶的活性具有激活作用，Mg^2 ，Li 和K 对酶有轻微的抑制作用，而Pb^2 ，Mn^2 和EDTA对酶有很强的抑制作用，Ca^2 ，Na^2 对黄缮蛋白酶既无明显的激活作用，也无明显的抑制作用．     

烟草叶片蔗糖酶的化学修饰

采用PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、TNBS、PCMB、DTT等8种化学修饰剂在一定的条件下选择性修饰蔗糖酶,研究烟草蔗糖酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明:PMSF、NBS、PCMB等3种化学修饰剂能显著地抑制酶的活力,而BrAc、IAc、TNBS、SUAN、DTT等对酶的活力影响不大.说明对丝氨酸残基、色氨酸残基和巯基的化学修饰后对酶的活力影响很大,而酶分子中的组氨酸残基及赖氨酸残基不在酶的活性中心,修饰后对酶的活力没有直接影响.     

菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

从菜青虫表皮分离纯化N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase），获得电泳单一纯的酶制剂，通过化学修饰法研究该酶的活性必需基团．分别以碳化二亚胺（EDC）、N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、对-氯汞苯甲酸（pCMB）、二硫苏糖醇（DTT）、澳代乙酸（BrAc）和乙酰丙酮在特定条件下对该酶进行特异的化学修饰，结果表明酸性氨基酸的侧链羧基、半胱氨酸巯基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、二硫键被修饰后，酶活性均显著下降，因此这些氨基酸残基是酶活性的必需基团，而精氨酸残基及赖氨酸ε-氨基被修饰后对酶活力没有影响，不是酶的必需基团．     

Aspergillus ficuum菊粉酶的化学修饰和荧光光谱

选用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、丁二酮(DIC)、氯氨-T(Ch-T)、碳二亚胺(EDC)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)等化学修饰剂,通过对Aspergillus ficuum内切和外切菊粉酶进行修饰,以研究菊粉酶分子中氨基酸侧链基团对酶活性的影响.研究结果表明:内切菊粉酶和外切菊粉酶活性中心的必需氨基酸残基均含有色氨酸和羧基氨基酸,且内切和外切菊粉酶活性中心的色氨酸残基数目分别为1和2;组氨酸可能是酶活性中心的组成基团.荧光光谱法研究表明:内切菊粉酶的色氨酸残基比外切菊粉酶的色氨酸残基所处环境的极性大,对环境的变化更敏感,并且更加暴露,表明这两种酶具有不同的构象,这种构象上的差别可能是导致二者对底物菊粉作用机理不同的原因.     

福寿螺β-葡萄糖苷酶催化功能基团

应用化学修饰法研究福寿螺β－葡萄糖苷酶活性功能基团的性质．用５，５′－二硫代双（２－硝基苯甲酸）和对－氯汞苯甲酸为修饰剂修饰酶分子中的巯基，酶活力基本不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ－溴代琥珀酰亚胺在ｐＨ６．０下修饰酶后，可使酶活力完全丧失，被修饰后的酶分子在２７８ｎｍ处的紫外吸收峰逐渐下降至完全消失，３３８ｎｍ处的荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基团之一．用碳二亚胺、溴代乙酸或甲醛修饰酶，可以使酶活力完全丧失，说明羧基、组氨酸的咪唑基及赖氨酸的氨基也与酶活性有密切的关系．用乙酰丙酮、苯甲磺酰氟修饰酶，酶活力不受影响，表明精氨酸残基和羟基与酶活性无关．     

长毛对虾碱性磷酸酶功能基团的研究

用对－氯汞苯甲酸修饰该酶分子中的巯基，酶活力不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ溴代琥珀酰亚胺修饰酶后，活力完全丧失，修饰后的酶在２７５ｎｍ处的紫外吸收峰完全消失，３４０ｎｍ处荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基因之一．用甲醛、醋酸酐修饰氨基，溴代乙酸修饰咪唑基也可以使酶活力完全丧失，说明赖氨酸残基及组氨酸残基也是酶活性功能基因．用乙酰丙酮修饰精氨酸残基，酶活力下降了５０％，精氨酸残基可能与维系酶分子构象有关．     

富士苹果中多酚氧化酶活性的中心必需基团与抑制动力学

以源于苹果的多酚氧化酶(PPO)为对象,选取溴乙酸、乙酰丙酮、N-溴代琥珀酰亚胺、1,4-二硫代苏糖醇和对氯汞苯甲酸等具有相对专一性的氨基酸基团修饰剂,研究PPO的酶活性中心必需基团,并确定乙醇对PPO的抑制动力学特性.结果表明:富士苹果中的PPO蛋白结构中酶活性中心必需基团有组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基与色氨酸残基.抑制动力学实验表明:乙醇通过与PPO酶活中心基团的结合抑制PPO酶活性,其对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.14mmol.L-1,抑制类型为可逆的竞争性抑制.     

僧帽牡蛎碱性磷酸酶功能基团的研究

采用化学修饰法研究僧帽牡蛎碱性磷酸酶活性功能基团性质.酶经0.4mmol·L-1PCMB修饰30min后活力仍然保持不变,提示巯基与酶的活力无关;用二巯基苏糖醇(DTT)对酶进行修饰,当DTT浓度达到2.5mmol·L-1时,酶活力丧失98%,表明硫 硫键与酶活力有密切的关系;以N 溴代琥珀酰亚胺(NBS)修饰酶的色氨酸残基,酶的修饰失活呈一级反应,当NBS浓度达到0.65mmol·L-1时,酶活力丧失100%,并辅以紫外吸收光谱的变化分析,表明色氨酸残基是酶催化活力所必需的;醋酸酐、马来酸酐、甲醛等氨基试剂对酶的修饰作用显示氨基是酶的必需基团.     

果菠萝蛋白酶催化功能基团的研究

以菠萝果为材料,应用本实验室开发的工业生产法工艺制备粗酶制品,进一步经DEAE-纤维索(DE-52)和 Sephadex G-75柱层析纯化,获得圆盘电泳单一纯的果酶制剂,测定酶的分子量为29 800,含 19种不同氨基酸,总残基数为286个。化学修饰研究结果表明:巯基、氨基、Trp残基和唯一的His残基是酶活性必需基团,而Ser和羧基与酶活性无关。用邹氏作图法判断 Trp残基的必需基团数,表明酶分子中六个Trp残基仅有一个是酶活性所必需的。     

内切酶xhoI部分氨基酸残基的化学修饰

限制性核酸内切酶xho I能够被巯基试试剂和修饰赖氨酸、精氨酸残基的试剂抑制,酶的抑制作用遵守假一级动力学,底物λ-DNA对酶的抑制作用有强烈地保护作用,这些资料表明xho Ⅰ含有对酶活性至关重要的必须的赖氨酸残基、精氨酸残基和巯基。     

限制性核酸内切酶Pst Ⅰ活性基团的研究

分别以N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）,2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异口唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸,精氨酸残基和羧基对RtⅠ活性的影响．结果表明,NBS的修饰虽可导致Pst Ⅰ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非Pst Ⅰ的活性基团,而精氨酸残基和羧基的修饰可导致PstⅠ和Rst Ⅰ活性丧失,并按Keech和Farrant动力学方法分析得出无论在原活性还是星号活性条件下,有一个精氨酸残基和两个羧基是Pst Ⅰ的活性基团．     

藻红蓝蛋白裂合酶F亚基中色氨酸残基的化学修饰

以N-溴代琥珀酰亚胺作为修饰剂,对藻红蓝蛋白裂合异构酶F亚基中的色氨酸(Trp)残基与酶活性的关系进行了研究.研究表明, PecF的Trp残基均位于分子内部,NBS的修饰导致了酶活性的显著降低,但并未完全失去活性.酶被修饰后的荧光和圆二色谱均发生了变化,为酶的结构和功能间关系研究提供了重要信息.     

猪肾胆绿素还原酶活性基因的修饰

报道采用专一性试剂ＤＴＮＢ、ＮＥＭ、磷酸吡哆醛以及２，３－丁二酮对胆素还原酶活性进行修饰，当这几种试剂分别与该反应后，酶活性性大幅度降低；而当预先加入ＮＡＤＰＨ或胆绿素、酶活性明显受到保护，这些结果表明，半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与该酶同ＮＡＤＰＨ和胆绿素结合、以及胆绿素还原成胆红素的反应有关，是该酶活性必需的基因。     

限制酶Bsp63Ⅰ的化学修饰与抑制动力学研究

经亲和层析得到Ｂｓｐ６３Ⅰ用对氯汞苯甲酸、磷酸吡哆醛、２，３－丁二酮修饰该酶的巯基、赖氨酸、精氨酸残基，结果表明：这些基因均与该酶活性有关。动力学研究表明磷酸吡哆醛对酶的抑制是一种类反竞争性抑制。     

中华猕猴桃蛋白酶羧基的化学修饰

有关中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin,E C 3、4.22.14)催化功能基团的研究表明:CYSH—25、His—161为酶活性部位必需基团,而Lys和Trp残基为酶活力表现所必需。本文中报道应用水溶性碳二亚胺(EDC)修饰动力学方法,进一步探讨羧基     

家蚕碱性磷酸酶的功能基团研究

用PCMB、NBS、PMSF、TNBS、SUAN、DTT、BrAc、IAc等在一定条件下选择性修饰家蚕碱性磷酸酶的部分氨基酸残基,对酶活力的变化进行测定.结果表明:PMSF、SUAN、BrAc、IAc和TNBS的修饰能显著抑制酶的活性,且酶活力降低程度与修饰剂的浓度相关;PMSF、DTT和NBT的修饰对酶的影响较小.初步认为,巯基和组氨酸的咪唑基可能是家蚕碱性磷酸酶的必需功能基团,赖氨酸残基和二硫键对保护酶的催化能力是必需的.